擴增後,兩種PCR產物能用限制性內切核酸酶消化

2020-11-25 歷史小咖咖會

因此，設計與靶mRNA的3"非翻譯區相結合的基因特異性寡核苷酸作為引物是一種很好的選擇。 oligo (dT)作為合成第一鏈cDNA的引物是最佳選擇，

當其他引導方法都不能令人滿意時，產物沒有特異性要求且允許產生長短不一的cDNA分子，可考慮應用隨機六寡核苷酸作為引物。

當使用隨機六寡核苷酸或oligo (dT)作為cDNA第- -鏈合 成的引物時，最好在室溫下配製反應體系，在25'C孵育10min後再置於37C。低溫孵育有助於反轉錄酶引導衍生反應，並可以阻止引物-RNA複合物的過早解鏈。

對照

在設置RT-PCR時應始終包括陽性與陰性對照。陰性對照指樣品在RT-PCR實驗中不加反轉錄所必需的成分。然而，陽性對照則需要更多技巧，因為它們要求有能反轉錄成cDNA的標準靶RNA樣品，並與實驗管樣品擴增靶序列平行進行。

理想的陽性對照是由己定量的RNA組成，該RNA應該是來自靶DNA突變體克隆的轉錄物。這種精確的靶RNA標準樣品最好與實驗管的靶RNA樣品僅存在一- 個或兩個鹼基差異，這樣RT-PCR擴增樣品能產生一至多個新的限制性酶切位點。

靶RNA與標準RNA樣品二者應該能用同一-對引物進行PCR擴增( Becker- Andre and Hahlbrock 1989; Wang et al. 1989; Giiand et al. 1990; Siebertand Larrick 1992)。 擴增後，兩種PCR產物能用限制性內切核酸酶消化，再通過瓊脂糖凝膠電泳鑑別( Becker Andre 1993 )。

相關焦點

  • 防止限制性內切核酸酶消化連接反應過程中產生的重組體
    限制性內切核酸酶的作用是在限制位點切割質粒分子自連接產生的環狀和線性多聯體。該方法需要質粒與靶DNA分子的連接破壞限制性酶切位點，以防止限制性內切核酸酶消化連接反應過程中產生的重組體。14 DNA理按酶3U調整H2O的加入量，使最終的反應體積為20μL°設置對照反應，包含.上述列出的所有試劑，除了擴增的靶DNA。2.在22'C孵育連接混合物4h。限制性內切核酸酶切割質粒DNA:在dNTP的存在下，T4 DNA聚合酶的3外切核酸酶活性補平擴增的DNA的末端。
  • 通過兩種限制性內切核酸酶在不同序列切割,產生不同的末端
    用兩種合適的限制性內切核酸酶消化載體(10μg) 和外源DNA。製備閉合環狀質粒軟體用於定向克隆，通過兩種限制性內切核酸酶在不同序列切割，產生不同的末端。只要可能。儘量避免使用多克隆位點上切割序列相互之間位於12bp 以內的兩種限制性內切核酸酶，因為在其中一個位點被切割後，第二個位點將太接近線性DNA的末端，從而不利於第二種酶的有效切割。
  • 用限制性內切核酸酶進行酶切,再連接到具有相應末端的載體上
    10.若用礦物油覆蓋在微量離心管內樣品液體的上層(步驟7),反應結束後可用150μL氯仿抽提去除。在PCR管內，包含擴增DNA片段的水相與上層礦物油的界面形成寫月面，在彎月面下面的水相還有膠束，可用自動移液器小心吸取水相液體轉移到一個新的離心管內。注意，如用微量滴定板作為PCR的反應管，就不能用氣仿抽提的方法來去除礦物油，因為這種塑料製品不能接觸耐有機溶劑。
  • 工程中使用的工具酶很多,包括限制性內切核酸酶、DNA 連接酶
    它所涉及的過程可用「分(合成)、切、連、轉、選、鑑」六個字表示。分(合成):指DNA的製備，包括從生物體中分離或人工合成。分離製備或合成製備DNA的方法都有很多種。切:即在體外將DNA進行切割，使之片段化或線性化。
  • 限制性內切核酸酶的作用特點,將它們分為三大類
    二、限制性內切核酸酶的命名和分類(一)限制性內切核酸酶的命名按照國際命名法,限制性內切核酸酶屬於水解酶類。由於限制性酶的數量眾多,而且越來越多，並且在同一種菌中發現幾種酶。為了避免混淆，1973 年Smith和Nathans對內切酶的命名提出建議，1980 年, Roberts 對限制性酶的命名進行分類和系統化。(二)限制性內切核酸酶的分類限制性內切核酸酶的作用特點，將它們分為三大類。1. I類限制性內切核酸酶I類限制性內切核酸酶的分子量較大，一般在 30萬道爾頓以上，通常由三個不同的亞基所組成。
  • PCR及其它核酸擴增技術
    這樣可以在第一輪擴增時進行少量擴增，從而限制了非特異性產物。第二套嵌套引物只能從第一輪擴增中擴增出目標產物，而不是非特異性產物。這樣可以運行更多的總周期，同時最大程度地減少非特定產品。這對於稀有模板或具有高背景的PCR很有用。巢式PCR的好處在於，如果第一次擴增產生了錯誤片段，則第二次能在錯誤片段上進行引物配對並擴增的概率極低。
  • 在該方法中,重疊序列被設計引入用於擴增靶DNA和載體的PCR引物
    載體和PCR產物的序列是經過設計的，以保證四種鹼基中的其中一種不會出現在3'端的前12個核苷酸中。在這種dNTP存在的情況下，通過T4 DNA聚合酶的3'→5'外切核酸酶活性可以產生指定長度的互補尾巴。
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    pcr擴增在做實驗的時候是經常用到的，它是基礎實驗，是每個做實驗的人都應該掌握的，下面小編就來說一下PCR擴增的原理和步驟吧。1.pcr擴增的基本原理是PCR技術和DNA的天然複製過程基本是一樣的，其靶序列兩端互補的寡核苷酸引物與其特異性依賴於與DNA的半保留複製。
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  • PCR常見問題總(3)
    ④避免引物內部出現二級結構，避免兩條引物間互補，特別是3'端的互補，否則會形成引物二聚體，產生非特異的擴增條帶。⑤引物3'端的鹼基，特別是最末及倒數第二個鹼基，應嚴格要求配對，以避免因末端鹼基不配對而導致PCR失敗。⑥引物中有或能加上合適的酶切位點， 被擴增的靶序列最好有適宜的酶切位點， 這對酶切分析或分子克隆很有好處。