用限制性內切核酸酶進行酶切,再連接到具有相應末端的載體上

另外，多餘的引物存在也會造成不利的影響，因為引物的3'端會與cDNA的加尾反應相競爭。

3.去除過剩的寡核苷酸或隨機六寡核苷酸引物可用QIAGEN Spin-20 或Qiaquick離心柱處理。

10.若用礦物油覆蓋在微量離心管內樣品液體的上層(步驟7),反應結束後可用150μL氯仿抽提去除。在PCR管內，包含擴增DNA片段的水相與上層礦物油的界面形成寫月面，在彎月面下面的水相還有膠束，可用自動移液器小心吸取水相液體轉移到一個新的離心管內。

注意，如用微量滴定板作為PCR的反應管，就不能用氣仿抽提的方法來去除礦物油，因為這種塑料製品不能接觸耐有機溶劑。

11.通過使用QIAGEN公司的DNA Cleanup或Promega公司的Wizard SV凝膠或PCRClean-Up方法，從擴增的DNA產物中分離去除殘留的熱穩定DNA聚合酶和dNTP.DNA片段現在可以連接到--種平末端載體或T載體，或者用限制性內切核酸酶進行酶切，再連接到具有相應末端的載體上。

疑難解答

問題(步驟9):全長克隆少。

解決方案:克隆數量少的很多情況是由於反轉錄過程的效率低下。如果RNA發生降解或mRNA的5'端富含G和C殘基，反轉錄酶就很難穿過穩定的二級結構區。克隆產量問題可以通過以下方法解決。

●在高溫下進行反轉錄反應(用鼠反轉錄酶可升至55C),或使用熱穩定反轉錄酶(如Tth聚合酶，Retrotherm)。