技術 酶切啊酶切,切還是不切?

2021-01-20 解螺旋

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作者：解螺旋.毛博 解螺旋原創

轉載請註明來源：解螺旋，醫生科研助手


酶切，作為一種常用的分子克隆的手段，如果應用得當，可謂寶刀屠龍，無往而不利；如果應用不當，又會步步維艱。真是讓人歡喜讓人憂愁。酶切，最常見的問題就是切不動和切過了。這些問題比較複雜。毛博準備分兩節來講。下面，毛博先講一講切不動的問題。


切不動可能的原因：


1. 酶不匹配


解決的方法：如果是雙酶切A和B，預實驗中必須做A和B各自的單酶切和A+B的雙酶切,好確認這幾種酶都好用，質粒上的切點都好用。


2. 體系的問題


解決的方法：酶切儘量用大體系，如50ul、100ul等。大體系能稀釋內切酶包裝中的甘油，對反應有利。


3. 酶的量太少


解決的方法：當設計一個酶切時，限制性內切酶的用量是與DNA分子的大小和量密切相關的。根據每種酶的單位定義，精確計算出所需的限制性內切酶的量。不要簡單的套用酶說明書中的「通用酶切方案「，那個通用酶切方案是很多酶切切不動的原因。


這裡，毛博隆重推薦一款酶切利器：3D(Double Digestion Designer)。該軟體的一個主要功能就是根據不同限制性內切酶的單位定義，以及你底物DNA分子的大小以及DNA的量（ug數）來精確計算出完全酶切你的DNA底物所需要的酶量，為完全酶切提供夯實保證。



4. 酶失活


如果限制性內切酶因為保管不當，導致酶失活或部分失活，那麼依據3D計算出來的酶量就不能保證完全酶切。解決的方法：保管好你的酶。如果過期了，就不要用了。


5.DNA的問題


如果製備的質粒DNA的質量不好（如細菌培養時間過長，質粒製備時裂解不充分或裂解時間過長等），那麼對這種質粒DNA進行酶切時，即使酶活性正常，酶量足夠，也不能實現完全酶切，因為其中很多質粒DNA已經變性，不能被切開。

解決的方法：保證質粒DNA的質量。這裡可以參考毛博的上一篇文章《質粒啊質粒，你到底要鬧哪樣？》


下面，毛博給大家看一個簡單的實例。

如果要用AcsAB + pSB1C3對質粒DNA進行雙酶切，以便進行某基因的克隆。

那麼，應該同時設計並進行三種酶切反應：

A: AcsAB + pSB1C3雙酶切

B: AcsAB單酶切

C: pSB1C3單酶切


在酶切時，A，B，C三種酶切反應都用相同的buffer系統，相同的DNA量（建議至少0.5ug）， 所需的酶量用3D進行計算。在合適的溫度（37°C）酶切1～2個小時， 然後進行電泳分析。電泳分析時，添加兩種對照：未酶切的質粒DNA和分子量標準（Marker）。


根據電泳的結果，就可以知道酶切是否完全：


如果一切正常，完全酶切後電泳的條帶分布如下：


單酶切(B和C)應該只有一條線性化的DNA條帶，其大小與質粒的理論長度一致；


未進行酶切的質粒DNA應該主要是一條超螺旋條帶，其電泳位置應該在單酶切 產生的線性DNA分子的前面。(有的質粒會在超螺旋條帶的後面出現線性化條帶和環狀DNA條帶）；


雙酶切的條帶應該只有一條帶，而且大小與單切的位置一樣(注意：只有當兩個酶切位點間沒有大片段插入時，才如此。事實上，大部分質粒的多克隆位點都是如此)。



如果出現以下的情況，就表明有問題：


單酶切後（B和/或C），與未酶切的DNA樣品(D)的電泳位置一樣（即依然為超螺旋）

出現線性化質粒及超螺旋質粒兩條帶。


這意味著：AcsAB和/或pSB1C3未能完全切開，原因可能是酶部分失活，或者質粒的質量有問題。 此時，即使雙酶切只出現一條線性化DNA條帶，也可能在線性化質粒中存在大量的單酶切的載體。


用此種載體進行克隆，則在連接時會出現大量的單酶切載體的自連（載體自連的效率較雙片段連接高10倍以上），導致大量的自連克隆，很難挑選到有插入的克隆（克隆失敗）。如果出現此種現象，建議不要盲目地做下去。應該先停一停，首先逐一查找可能的原因。只有當上述兩種可能的問題都解決了，才能保證完全酶切，進而獲得正確的克隆。


以上是毛博總結的酶切的常規經驗，當然還是會有特例比較難做，因為其中涉及到酶量的計算，Buffer的選擇，反應體積，反應條件等多種條件摸索。一旦出現問題，大家需要耐心細緻，逐一查找可能的原因。



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