做實驗 | 一篇載體構建的實操指南

Gene Name：Nrf2

Cloning Vector：Plvx-DsRed-monomer-C1

Cloning Strategy：EcoRI+BamHI

載體構建

載體構建（vectorconstruction）是分子生物學研究常用的手段之一。依賴於限制性核酸內切酶、DNA連接酶和其它修飾酶的作用，分別對目的基因和載體DNA進行適當切割和修飾後，將二者連接在一起，再導入宿主細胞，實現目的基因在宿主細胞內的正確表達。

實驗步驟

1.載體選擇：

根據所要構建的質粒目的的差異以及載體和目標片段的酶切位點分析結果來選擇載體。以Nrf2基因序列：1794bp 為例；

2.引物設計：

引物設計的目的是將目標片段擴增出來以便與載體連接。

Nrf2pC1EcoR-F：CGGAATTCCGCCACCATGATGGACTTGGAGTTGCCACC

Nrf2pC1BamH-R：CGGGATCCCTAGTTTTTCTTTGTATCTGGCTTCTTGC

3.PCR擴增：

以小鼠光感受器細胞cDNA為模板，PCR擴增目的基因，在引物兩端分別引入EcoRI和BamHI的酶切位點，1%瓊脂糖凝膠回收目的基因DNA條帶（1794bp）。

4.載體和目標片段的限制性酶切：

質粒載體Plvx-DsRed-monomer-C1和目的基因PCR產物的EcoRI和BamHI雙酶切，酶切反應在37℃水浴反應2h；1%瓊脂糖凝膠電泳分別回收質粒Plvx-DsRed-monomer-C1酶切大片段和目的基因酶切片段。

5.連接轉化：

質粒Plvx-DsRed-monomer-C1 EcoRI+BamHI酶切回收大片段與目的基因連接，連接反應在16℃反應12小時。取10ul連接產物與100ul DH5a感受態細菌混勻後冰浴30min，42℃熱激90s，立即置冰上放置5min,加入預熱至室溫的700ul LB培養基， 37℃恆溫搖床培養50min，吸取 200ul的菌液，用移液器混勻後均勻塗布於含100ug/ml Ampicillin抗性的LB平板上， 37℃恆溫培養箱倒置培養過夜。

6.挑取克隆提質粒驗證：

挑取5個單菌落接種於含5ml，100μg/ml Ampicillin抗性的LB培養液中，300rpm，37℃恆溫搖床培養過夜，對過夜的菌液進行擴增，選擇陽性菌液，用質粒小量提取試劑盒提取質粒，再進行測序驗證。

Nrf2基因序列：1794bp

PCR反應條件：

PCR反應程序：

酶切體系（載體）：

酶切體系（目的基因）：

連接反應體系：