1. 前言
在做miRNA相關的實驗時，最終都要做到miRNA的靶基因上時，有時候還要涉及miRNA靶基因的功能實驗，這個時候有就可能用到RNAi技術，或者是說純粹地研究某個基因的功能，也可以使用RNAi技術。RNAi的實現手段通常是兩種，一種是直接買siRNA寡核苷酸片段，轉染到靶細胞中；另外一種是利用shRNA慢病毒載體構建穩轉的細胞系，shRNA在細胞中被加工為siRNA，進而發揮RNAi作用。
2. 常見shRNA載體
現在shRNA最經典的載體就是Sigma的pLKO.1-puro，貨號是SHC001，在Sigma官網上查了一下，其實還有另外一種載體，叫TCR2-pLKO.5-puro，貨號為SHC002，這兩者的區別就在於pLKO.5-puro比pLKO.1-puro多了一個WPRE元件，WPRE元件增強了慢病毒遞送的轉基因的表達，這兩個載體的其他部分完全相同，這兩個載體的圖譜如下所示：
pLKO.1-puro載體帶有嘌呤黴素篩選標記，也就是名稱中的puro，因此可以使用嘌呤黴素來進行篩選。Sigma公司自身也有shRNA文庫，有各種基因的shRNA載體，如果不想自己設計，也可以直接購買。原始pLKO.1-puro質粒的長度為7052bp，也是沒有插入任何shRNA片段的質粒，當插入shRNA片段後，pLKO.1-puro質粒的長度為7,086 bp，插入的shRNA片段兩端的酶切位點是AgeI和EcoRI，此載體插入片段的示意圖如下所示：
從上圖可以知道，設計shRNA慢病毒載體的關鍵就是中間的莖環部分。
3.shRNA片段的設計
我們以文獻中的某個基因為例說明一下如何構建shRNA，就以下面的這篇文獻為例進行說明，文獻信息如下所示：
Hoshika Y ,Takahashi F , Togo S , et al. Haploinsufficiency of the folliculin gene leadsto impaired functions of lung fibroblasts in patients with Birt-Hogg–Dubésyndrome[J]. Physiological Reports, 2016, 4(21):e13025.
此文獻中使用的就Sigma的pLKO-puro載體，敲減的基因是FLCN，靶細胞是HFL1，即人胚肺成纖維細胞，現在我們以這個FLCN這個基因為例，說明一下如何使用Sigma的官網來設計shRNA。
我們在Sigma官網上查詢相應的shRNA，輸入網址：
http://www.sigmaaldrich.com/life-science/functional-genomics-and-rnai/sirna/mission-predesigned-sirna.html
如下所示：
點擊Search，出現以下界面：
單擊FLCN，出現有關FLCN的各種信息，下拉滾動條，找到shRNA相關的信息，找人源的，如下所示：
單擊右側的價格二字，會出現有關FLCN這個基因的shRNA序列，如下所示：
如果序列中出現上述紅色方框中的VALIDATED字樣，說明此序列已經被驗證過了，就可以直接使用，此文獻中使用了前兩條shRNA序列，之所使用兩條shRNA序列，這是因為shRNA經過加工後形成的siRNA有一定脫靶效應，因此不少文獻中都使用兩條shRNA。
我們以第1條序列，也就是以下的這一條序列為例說明一下它的構建原理以及如何連接到pLKO-puro載體上。
序列如下：
CCGGGATGGAGAAGCTCGCTGATTTCTCGAGAAATCAGCGAGCTTCTCCATCTTTTTG
此時將這個序列中的各個部分標出來，如下所示：
從上面的圖上我們可以看出，中間的紅色部分就是最終形成莖環的部分，左側的藍色部分序列是CCGG，與右側的綠色部分是TTTTTG，這兩個序列都是與pLKO-puro載體連接的部分，其中CCGG是AgeI酶切位點的粘性末端，TTTTTG則是保證了shRNA轉錄出來後，其末端是連續的4個U，即UUUU。藍色與紅色部分的黑色字母標註的部分則是與FLCN的CDS互補的序列。
所有由pLK-puro這個載體構建的shRNA載體的這兩部分都是一樣的，其中藍色與紅色之間的這一部分是21個nt，紅色與綠色這一部分也是21個nt，它們是互補的，公式就是下面的這個樣子（從左到右，是5』到3』）：
CCGG—21bp sense—CTCGAG—21bpantisense—TTTTTG 3
按照它轉錄出來，形成的莖環結構如下所示：
第1條鏈基本上都可以在Sigma的官網上查到，現在我們設計第1條shRNA的反義鏈序列，前面提到，pLK-puro空載體上用於連接shRNA的兩個酶切位點是AgeI與EcoRI，因此在設計反義鏈的時候，需要添加上EcoRI的酶切位點的粘性末端，如下所示：
將上面的反義鏈順序按照5』到3『排列就是下面的這個樣子：
AATTCAAAAAGATGGAGAAGCTCGCTGATTTCTCGAGAAATCAGCGAGCTTCTCCATC，
它的公式為：
AATTCAAAAA—21bp sense—CTCGAG—21bp antisense—3
因此，最終需要合成的序列就是這兩條:
第一條（Sigma官網提供）：CCGGGATGGAGAAGCTCGCTGATTTCTCGAGAAATCAGCGAGCTTCTCCATCTTTTTG
第二條（自己設計）：AATTCAAAAAGATGGAGAAGCTCGCTGATTTCTCGAGAAATCAGCGAGCTTCTCCATC
雖然設計完靶基因的shRNA片段後，但是在後續的實驗中，還需要有相應的對照，根據Sigma提供的信息以及文獻中的內容，對照通常要做兩個，一個是空載體，也就是沒有插入shRNA片段的pLKO載體，另外一個就是含有一個沒有靶向任何基因的shRNA的載體（sigma官網的貨號是SHC002）,但是網上也能查到載體中的這段序列，如下所示：，
CCGGCAACAAGATGAAGAGCACCAACTCGAGTTGGTGCTCTTCATCTTGTTGTTTTTG。在構建shRNA慢病毒載體時，就可以使用這個shRNA片段來作為陰性對照。
參考資料
https://www.sigmaaldrich.com/china-mainland/life-science/functional-genomics-and-rnai/shrna/trc-shrna-products/shrna-controls.html
http://www.addgene.org/tools/protocols/plko/
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