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編譯：解螺旋.翠花
轉載需授權注來源：解螺旋，醫生科研助手
在研究基因功能中，RNAi由於可以特異地使基因沉默或表達量降低而成為生物實驗的強有力工具。其中shRNA慢病毒載體應用頗廣，今天小編告訴大家2種方法可以快速設計構建到慢病毒載體中的shRNA。
Sigma 公司做了一個針對人和小鼠的shRNA 庫，而且部分基因的shRNA序列經過驗證,因此直接使用Sigma 公司已驗證過的RNAi 序列最為方便。
首先打開網址：http://www.sigmaaldrich.com/life-science/functional-genomics-and-rnai/sirna/mission-predesigned-sirna.html，以Fli1為例，直接輸入基因名，點擊search，出現以下界面：
在Products中找到並點擊shRNA選項，然後出現這個界面：
點擊「MISSION shRNA Lentiviral Transduction Particles」這一行的PRICING，這時會彈出界面展示針對目的基因的shRNA：
當出現時，恭喜你，這個基因有被sigma驗證過，下拉可以找到驗證過的shRNA，用來構建慢病毒，簡單有效，敲減效率基本上是有保證的。如果沒有驗證過的shRNA，則根據需要多選擇幾條shRNA也是一樣能篩選到有效的靶點。提示：小編傾向選擇CDS區的shRNA，3UTR基本不選，而且選擇的每一條shRNA都會在NCBI上做BLAST，確保靶點是特異性的。Blast比對後最終確認選擇下面2條FLI1基因的shRNA：
需要特別提醒，如果要構建到慢病毒載體上，合成出去的shRNA引物會根據載體有些不一樣，sigma用的是pLKO.1載體，小編常用SBI的pGreenPuro(CMV) 載體，兩端的酶切位點是BamHI/EcoRI，設計出去的引物最終是這樣的（不同shRNA替換中間紅色部分）：
Sense: GATCCCCCTTCTGACATCTCCTACATCTCGAGATGTAGGAGATGTCAGAAGGGTTTTTG
Anti-sense: AATTCAAAAACCCTTCTGACATCTCCTACATCTCGAGATGTAGGAGATGTCAGAAGGGG
Life Technologies公司有個非常實用的在線shRNA設計軟體，操作非常方便，而且設計出來的shRNA不再需要到NCBI上Blast，直接可以用的。
首先打開網站：http://rnaidesigner.lifetechnologies.com/rnaiexpress/，在Target Design Options處選中shRNA，以Fli1為例，輸入Accession number或Nucleotide sequence，其他條件不變：
下拉到底點擊RNAi Design，然後出現推薦的10條靶點序列：
根據Rank評星，選擇其中需要的（翠花一般選擇4條，不同位置各一條），點擊Design shRNA Oligos：
然後在Default Loop Sequence選擇合適的序列（翠花用的載體是pGreenPuro，不需要這個序列，就默認了，後面合成引物的時候要去掉的），在Custom Loop Sequence處輸入CTCGAG，點擊Design：
得到shRNA
提醒：合成出去的引物需要做微調，根據載體的要求，和sigma的設計一樣，需要在前後加上酶切位點的，最後大功告成。
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