shRNA和siRNA

我發現我有個小習慣，就是同樣的文章，我一定要按照自己的思維整理一下才能真正記住。

我一直沒搞明白shRNA和siRNA這兩者的區別，今天看了一些資料，整理一下，以後就看自己的資料

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簡單點說，穩轉用shRNA病毒，瞬時實驗用siRNA。

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原理不同，shRNA是短髮卡RNA，siRNA是雙鏈小幹擾RNA。

前者在核內，後者在細胞質，我的理解是發揮作用最後都是在細胞質，shRNA在細胞內會自動被加工成siRNA，使靶基因沉默，且比siRNA 作用更穩定、高效。。

兩者都是通過基因沉默抑制蛋白表達的工具

圖 1. siRNA和shRNA結構。（A） siRNAs是短的RNA雙鏈，在3『端有兩個鹼基的游離。 

（B） shRNA由正義鏈和反義鏈通過環狀序列隔開共同組成。（C） shRNA 構建用於插入表達載體。

原理：長的雙鏈RNA與Dicer一起形成複合物，雙鏈特異性的核糖核酸酶III能夠將它們處理成帶有兩個游離鹼基的長度為21-23nt的siRNA。隨後這些siRNA片段與RISC結合，RISC由Argonaute-2 （Ago-2）、Dicer和TAR-RNA-結合蛋白（TRBP）組成。然後RNA的兩條鏈分開，其中一條鏈從複合物上分離。5'端雙鏈穩定性最低的那條鏈被選擇出來，穩定的併入沉默複合物中

在細胞核表達後，shRNA被Drosha加工然後由Exportin-5蛋白轉運到細胞質中，在細胞質中它們與Dicer結合去除環狀序列。在這一點上，它們與siRNA的加工方式（以短的雙鏈形態導入細胞，然後被Dicer識別）相同。在與RISC結合併去掉其中一條RNA鏈後，它們識別mRNA佔有互補序列，導致其降解。

具體解釋：

    shRNA在轉染/轉導細胞的細胞核中的合成，形成髮夾結構，莖區成對的反義和正義鏈與未配對的成環核苷酸連接在一起（圖1b和1c）。通過與miRNA的加工相同的RNAi機制，shRNA被加工成siRNA。使用細菌或病毒載體，shRNA被導入靶細胞的細胞核內，在某些情況下，載體可以穩定地整合到基因組中。根據驅動表達的啟動子的不同，shRNA可被RNA聚合酶II或者III催化轉錄。在被Exportin-5轉運到細胞質之前，這些初始的前體結構需要首先用Drosha及其雙鏈RNA結合伴侶DGCR8加工形成pre-shRNA。pre-shRNA隨後被Dicer和TRBP/PACT酶切，去除發卡結構，產生在兩個3『末端帶有兩個游離鹼基的20-25nt的雙鏈siRNA。這一有活性的siRNA隨後被整合到沉默複合物上去。

    一旦被整合到RISC後，shRNA和siRNA識別靶mRNA和降解的過程基本上是相同的。作為RISC的一部分，siRNA通過鹼基互補配對以序列特異性的方式結合到靶mRNA，從而利用Ago-2的核酸酶H樣活性裂解靶RNA的雙鏈中心附近的磷酸骨架。某些生物的這個系統有一個有趣的特點，siRNA與靶mRNA的退火使siRNA作為引物，而靶mRNA作為依賴於RNA的RNA聚合酶的模板。這就合成出一個新的雙鏈RNA，然後由Dicer酶加工，形成正反饋循環，增加了siRNA的量。應當指出的siRNA通常需要完全同源才能誘導降解。該過程圖2中有闡述。

    人們對RISC發現靶mRNA的過程還沒有很好的理解。然而，Ameres等的報告顯示細胞mRNA的靶序列的親近性影響了它的剪切。他們還指出，RISC不是作用於未摺疊的RNA。他們提出了一個模型，在該模型中，RISC非特異性的方式通過隨機擴散與單鏈RNA接觸，5'末端鹼基配對比3'末端更有效率。這似乎決定了RISC與靶mRNA的穩定結合。

    shRNA比siRNA的優勢包括能夠使用病毒載體進行轉染，克服了某些類型的細胞不能轉染的難題，能選擇使用誘導型啟動子控制shRNA表達，能夠與報告基因共表達。此外，它們能減少脫靶效應。

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❤如何設計shRNA?

        shRNA應包含正義和反義序列（每個為19-21個核苷酸的長度）由環結構分隔，以及5'端AAAA的游離片段。設計環結構時，Ambion的科學家和其他人建議使用9nt的空白間隔（TTCAAGAGA），而Invivogen在某些載體中採用了長度為7nt的環（TCAAGAG），這可根據您的系統變化。3〜9個核苷酸長度的環序列被證明是有效的。此外，當創建shRNA盒時，正義鏈首先合成，然後是間隔序列，最後是反義鏈。 

        shRNA結構中5'端游離應避免，因為它們可能會導致shRNA的沉默。除了手動設計siRNA或shRNA，也有一些設計程序可供使用。

💗這裡看到一個帖子：http://blog.sciencenet.cn/blog-1509670-1190817.html

1. Sigma網站

Sigma公司做了一個針對人和小鼠的shRNA庫，而且部分基因的shRNA序列經過驗證，因此直接使用Sigma公司已驗證過的RNAi序列最為方便。

首先打開網址：http://www.sigmaaldrich.com/life-science/functional-genomics-and-rnai/sirna/mission-predesigned-sirna.html出現以下界面：

以NLRP3基因為例，直接輸入基因名，點擊search，出現以下界面:

在Products中找到並點擊shRNA選項，出現以下界面：

點擊「MISSION shRNA Lentiviral Transduction Particles」這一行的「價格」，這時會彈出界面展示針對目的基因的shRNA，界面如下：

註：建議選擇CDS區的shRNA，3UTR基本不選，而且選擇的每一條shRNA儘量在NCBI上做下BLAST，確保靶點的特異性。

2. Life Technologies網站

Life Technologies公司有個非常實用的在線shRNA設計軟體，操作非常方便，而且設計出來的shRNA不需要再到NCBI上Blast，直接可以使用。

首先打開網址：https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/sort.do，在Target Design Options處選中shRNA，以NLRP3基因為例，輸入Accession number或Nucleotide sequence，其他條件不變：

然後在「Default Loop Sequence」選擇合適的序列，在「Custom Loop Sequence」處輸入合適的loop環序列，點擊Design，即得shRNA序列。

shRNA序列設計特徵如下：

下拉點擊「RNAi Design」，出現如下頁面：

選取原則：1.避免選取GGG和CCC等高GC序列 ；2.ShRNA目的序列的第一個鹼基必須是G以確保RNA聚合酶轉錄。如果選擇的目的序列不以G開頭，必須在緊連正義鏈的上遊加一個G。

根據Rank評星，從中選取合適靶點序列（一般選擇4條，不同位置各一條），點擊Design shRNA Oligos：

詳細看原連結。

💗現在常用的RNAi的研究策略有三種：
        第一種即為直接合成針對靶基因的siRNA(合成的是RNA,不是DNA),通過轉染（有用於siRNA轉染的試劑）的方法使之進入細胞內，參與到RNAi途徑，發揮使靶基因沉默的效應。這一方法受轉染效率的影響較大，而且能順利的進入RNAi途徑的效率怎麼樣，還有待驗證。不過目前有不少基因的siRNA已經有商業產品，所以使用時買來就可以了，比較方便。
而且直接合成的siRNA可以進行小分子多肽等配體標記，可進行體內研究，注入體內後，通過配體的識別，被特定的細胞吸收，在特定的靶細胞內實現RNAi研究。
        二是構建shRNA的質粒表達載體，轉染細胞，在細胞內轉錄生成shRNA,利用細胞內的Dicer酶，生成相應的siRNA，發揮RNAi作用。
        三是構建shRNA的病毒表達載體，常用的病毒載體有腺病毒載體、腺相關病毒載體、慢病毒載體等，機制與質粒載體相似，利用了病毒感染細胞效率比較高的特點，解決了用質粒載體轉染效率低的缺陷。