使用Lipofectamine™2000轉染Stealth™ RNA或者siRNA進入哺乳...

2021-01-10 生物谷
前言
Lipofectamine™ 2000試劑是一項專利配方，用於高效轉染Stealth™ RNA或者短的幹擾RNA（siRNA）到哺乳動物細胞，以進行RNAi分析（1，2）。該說明書提供了一般的指導以及使用Lipofectamine™ 2000轉染Stealth™ RNA或者siRNAj進入哺乳動物細胞的步驟。提供推薦的起始使用試劑劑量。為了獲得最佳的RNAi實驗結果，需要針對哺乳動物細胞系和目的基因優化轉染的條件。
影響基因阻斷水平（Gene Knockdown Level）的因素
在RNAi實驗中，有許多因素影響目的基因表達程度的降低（例如：基因阻斷），包括：·轉染效率
·目的基因轉錄效率
·蛋白質穩定性
·所選擇特異StealthTMRNA或者siRNA序列的效率　
·所選擇哺乳動物細胞系的生長特徵
當設計轉染和RNAi實驗時，需要考慮這些因素。如果需要更多的信息幫助您成功的進行RNAi實驗，查閱標題為"RNAi成功的七個步驟"的文獻。隨同StealthTMRNA訂貨可以得到說明書，也可以從我們的網站（www.invitrogen.com）下載或者通過與技術服務聯繫獲得說明書。
轉染的一般性指導
使用Lipofectamine™ 2000轉染Stealth™ RNA或者siRNA進入哺乳動物細胞時，遵從以下一般性指導：
1 為了獲得最佳基因阻斷結果，每一種細胞系轉染Stealth™ RNA或者siRNA的量都需要經過實驗確定。如果您是首次轉染您的細胞系，推薦嘗試使用幾個Lipofectamine™ 2000的濃度，並在20-100nM範圍內改變Stealth™ RNA或者siRNA的濃度，以確定達到最佳基因阻斷水平所需要的條件。高濃度的Stealth™ RNA或者siRNA可能具有細胞系依賴性。註：我們推薦開始時使用40nM Stealth™ RNA或者siRNA。
2 在30-50％細胞匯合度時進行轉染。通常基因阻斷的分析至少要在轉染後24-72小時進行。低密度轉染細胞可以使轉染和分析之間更長的間隙更長，從而使由於細胞過度生長造成的細胞活性損害減少到最低。根據靶基因的特性，高密度轉染的細胞可能更加適合條件的優化。
3 不要在轉染時的培養基中加入抗生素，因為這將會降低細胞轉染的效率和導致細胞死亡。
4 為了獲得更好的結果，可以使用Opti-MEM® I 低血清培養基（目錄號31958-062）在形成複合物前稀釋Lipofectamine™ 2000和Stealth™ RNA或者siRNA寡聚物。
5 可以使用invitrogen BLOCK-iT™螢光寡聚物(BLOCK-iT™　Fluorescent Oligo)(目錄號　2013)幫助優化細胞系的轉染條件。一旦確定了用來轉染的最佳條件，在每一次實驗都包括BLOCK-iT™螢光寡聚物，作為轉染效率的指示劑。如果需要的更多的信息，請參閱BLOCK-iT™螢光寡聚物說明書，說明書可以通過我們的網站下載或者通過撥打技術服務熱線。
需要材料
開始實驗前準備下列試劑：·目的哺乳動物細胞系（使用傳代數低的細胞；轉染前確信細胞健康和超過90％的存活率）
·目的Stealth™ RNA或者siRNA寡聚物（20μM溶解在退火緩衝液中）
·Lipofectamine™ 2000試劑（使用前貯存在+4℃）
·Opti-MEM® I 低血清培養基（使用前37℃預熱）
·合適的組織培養板及其它
轉染步驟
使用Lipofectamine™ 2000轉染Stealth™ RNA或者siRNA進入哺乳動物細胞時，使用下述步驟。參閱下列表格《推薦試劑的量和體積》以確定加入不同組織培養方式的試劑量以及體積。使用推薦Lipofectamine™ 2000的量作為起始點，針對您的細胞系和Stealth™ RNA或者siRNA進行條件優化。
1 轉染前一天，在不包含抗生素的適量的培養基中接種細胞，轉染時細胞的匯合度要達到30-50％。
2 每一個轉染樣品都要按照如下的方法準備寡聚物- Lipofectamine™ 2000複合物：
a.　在適量的不包含血清的Opti-MEM® I 低血清培養基稀釋Stealth™ RNA或者siRNA寡聚物，輕輕混勻。
b.　使用前輕輕混合Lipofectamine™ 2000，然後稀釋適量的試劑到Opti-MEM® I 低血清培養基，輕輕混勻後在室溫下孵育5分鐘。
註：在30分鐘內混合稀釋的Lipofectamine™ 2000和稀釋的寡聚物。更長的孵育時間可能會降低活性。
c.　孵育5分鐘後，混合稀釋的寡聚物和稀釋的Lipofectamine™ 2000，輕輕混合，在室溫下孵育20分鐘，以便允許複合物的形成。溶液可能出現混濁，但是這不會影響轉染。
3 將寡聚物- LipofectamineTM2000複合物加入到每一個包含細胞和培養基的孔中。通過輕輕地前後搖動培養板混合。
4 37℃，CO2培養箱孵育24-96小時，直到適合進行基因阻斷分析。不需要去除複合物或者改換培養基；然而，在轉染後4-6小時改換培養基也不會損失轉染的活性。
推薦試劑量和體積
下表列出了通過各種組織培養方式轉染細胞時推薦使用試劑的量和體積。使用推薦量的Stealth™ RNA或者siRNA（參看第4列）和Lipofectamine™ 2000（參看第6列）作為實驗的起始點，針對您的細胞系和目的基因優化條件。註：20μM Stealth™ RNA或者siRNA＝20pmol/μl。
培養板相對表面積（相對24孔）鋪板培養基體積Stealth™ RNA或者siRNA（pmol）和稀釋體積（µl）優化Stealth™ RNA或者siRNA（pmol）的量Lipofectamine™ 2000（µl）和稀釋體積（µl）優化Lipofectamine™ 2000（µl）的量48孔0.4200 μl25 μl
10 pmol2-25 pmol0.5μl 25μl0.3-0.8 μl24孔1500 μl50 μl
20 pmol10-50 pmol1μl 50μl0.5-1.5 μl6孔52 ml250 μl
100 pmol50-250 pmol5μl 250μl2.5-6 μl
參考文獻：
1. Gitilin, L.,Karelsky,s.,and Andino,R.(2000) Nature 418,430-434.
2. Yu,J.L.,DeRuiter,S.L.,and Turner,D.L.(2002) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 99,6047-6052

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