今天，咱們講轉染......

2020-11-09 海星生物

01

轉染

將DNA導入細胞使得它可利用細胞自身的細胞機制表達和合成蛋白質，將RNA導入細胞則是用來通過終止翻譯來降低某特定蛋白的合成。

轉染的RNA在細胞質中發揮作用，DNA則需被轉運到細胞核中從而達到有效的轉染。在核內，DNA會被短暫表達或整合到基因組DNA而將該遺傳改變傳代到下一代細胞。


02

原理

所有化學轉染方法的基本原理類似。它們都是使用帶正電荷的承載分子和核酸結合併包裹核酸從而轉運到細胞內。這些帶正電荷的分子可以中和細胞膜表面的負電荷從而穿過膜來轉運其包裹的核酸。


脂轉染中，帶正電荷的脂類形成一個脂質體，然後與核酸結合一起形成一個轉染複合物。而磷酸鈣只是簡單地將DNA濃縮使其產生正電荷。此外，帶正電荷的聚合物如聚乙烯亞胺可將DNA濃縮成為帶正電荷的顆粒。

化學介導轉染的下一步是這些帶正電荷的複合物通過簡單的靜電吸引結合到帶負電荷的細胞膜。

然後複合物利用細胞內吞作用進入細胞內部 –細胞內吞是一種分子通過稱之為包涵體的包膜顆粒而進入細胞的過程。


一旦進入細胞，核酸以一種目前還未知的機制從內涵體釋放到細胞質，並最終到達細胞核，在那裡它被細胞機制轉錄生成mRNA，並進一步翻譯產生蛋白質。細胞質是小分子幹擾RNA或稱siRNA起作用的地方，它們通過幹擾蛋白質合成機制的一部分而降低蛋白質的生成。

轉染進入的DNA可以穩定或瞬時存在。穩定轉染是指轉染的DNA整合到基因組中並在細胞分裂後仍然保留。瞬時轉染時，DNA並不整合到基因組，其編碼的蛋白會在轉染後24到96小時後丟失。

通常將插入基因與報告系統連在一起來檢測DNA轉染的效率。這些系統可簡單地通過直接觀察報告分子，如綠色螢光蛋白，或用比色分析測量酶活性，如螢光素酶報告分子，來進行檢測。


siRNA沉默是否成功可通過免疫雜交目的蛋白的表達水平來判斷。成功轉染siRNA應該會降低細胞內目的蛋白的表達而不改變管家基因GAPDH的表達量。

03

過程

為達到最高轉染效率，細胞應在轉染時處於對數生長期，並處於40%到80%生長密度之間。這需要在轉染前一天收集細胞，計數，然後重新接種到多孔板中，接種濃度要使得轉染時能達到正確的細胞密度。


接下來，混合化學試劑和核酸，並孵育一段時間使它們形成核酸-試劑複合物。每種化學轉染系統中用到的各組分的濃度必須優化達到最佳。

然後將核酸-試劑複合物加入到平板生長的細胞中並孵育過夜使得複合物有足夠的時間結合到細胞並介導轉染。24小時後，需將培養液吸去換成新鮮培養液。


04

應用

轉染技術可以有很多的改動和應用。共轉染使得研究人員能夠研究錯義突變對細胞蛋白功能的影響。


另一個轉染的替代方法是電擊轉染。電擊轉染是使用電流來破壞細胞膜從而使得DNA或RNA在細胞得到修復前的短時間內進入到細胞內。這裡電極絲被放置在小鼠腦的周圍，讓電子短脈衝通過腦組織來進行離體轉染含RNAi的藍色溶液。然後觀察基因沉默對發育皮質結構的影響。


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