細胞轉染技術原理及應用

2020-12-01 中國教育..

    常規轉染技術可分為兩大類,一類是瞬時轉染,一類是穩定轉染（永久轉染）.前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色體中,因此一個宿主細胞中可存在多個拷貝數,產生高水平的表達,但通常只持續幾天,多用於啟動子和其它調控元件的分析.一般來說,超螺旋質粒DNA轉染效率較高,在轉染後24-72小時內（依賴於各種不同的構建）分析結果,常常用到一些報告系統如螢光蛋白,β半乳糖苷酶等來幫助檢測.後者也稱穩定轉染,外源DNA既可以整合到宿主染色體中,也可能作為一種游離體（episome）存在.儘管線性DNA比超螺旋DNA轉入量低但整合率高.外源DNA整合到染色體中概率很小,大約1/104轉染細胞能整合,通常需要通過一些選擇性標記,如來氨丙基轉移酶（APH；新黴素抗性基因）,潮黴素B磷酸轉移酶（HPH）,胸苷激酶（TK）等反覆篩選,得到穩定轉染的同源細胞系。

 

      轉染技術的選擇對轉染結果影響也很大,許多轉染方法需要優化DNA與轉染試劑比例,細胞數量,培養及檢測時間等.一些傳統的轉染技術,如DEAE右旋糖苷法,磷酸鈣法,電穿孔法,脂質體法各有利弊,其主要原理及應用特點如下：

 

磷酸鈣法

磷酸鈣DNA複合物吸附細胞膜被細胞內吞 穩定轉染
瞬時性轉染 不適用於原代細胞
操作簡便但重複性差
有些細胞不適用

 

DEAE-右旋糖苷法
帶正電的DEAE-右旋糖苷與核酸帶負電的磷酸骨架相互作用形成的複合物被細胞內吞 瞬時性轉染 相對簡便、結果可重複 但對細胞有一定的毒副作用 轉染時需除血清

 

電穿孔法
高脈衝電壓破壞細胞膜電位,DNA通過膜上形成的小孔導入 穩定轉染 瞬時性轉染
所有細胞 適用性廣但細胞致死率高,DNA和細胞用量大, 需根據不同細胞類型優化電穿孔實驗條件

 

病毒介導法
通過侵染宿主細胞將外源基因整合到染色體中 穩定轉染 可用於難轉染的細胞、原代細胞,體內細胞等

 

逆轉錄病毒
特定宿主細胞 但攜帶基因不能太大細胞需處分裂期 需考慮安全因素

 

腺病毒

通過侵染宿主細胞將外源基因整合到染色體中 瞬時轉染 特定宿主細胞 可用於難轉染的細胞
需考慮安全因素

 

陽離子脂質體法 帶正電的脂質體與核酸帶負電的磷酸基團形成複合物被細胞內吞 穩定轉染 瞬時性轉染
所有細胞 適用性廣,轉染效率高,重複性好,但轉染時需除血清.轉染效果隨細胞類型變化大

 

Biolistic顆粒傳遞法
將DNA用顯微重金屬顆粒沉澱,再將包被好的顆粒用彈道裝置投射入細胞,DNA在胞內逐步釋放,表達 瞬時性轉染 可用於：人的表皮細胞,纖維原細胞,淋巴細胞系以及原代細胞

 

顯微注射法
用顯微操作將DNA直接注入靶細胞核 穩定轉染 瞬時性轉染 轉染細胞數有限
多用於工程改造或轉基因動物的胚胎細胞

 

各種轉染方法的比較：
    除上述傳統方法外,近年來國際上推出了一些陽離子聚合物基因轉染技術,以其適用宿主範圍廣,操作簡便,對細胞毒性小,轉染效率高受到研究者們的青睞.其中樹枝狀聚合物（Dendrimers）和聚乙烯亞胺（Polyethylenimine,PEI）的轉染性能最佳,但樹枝狀聚合物的結構不易於進一步改性,且其合成工藝複雜.聚乙烯亞胺是一種具有較高的陽離子電荷密度的有機大分子,每相隔二個碳個原子,即每「第三個原子都是質子化的氨基氮原子,使得聚合物網絡在任何pH下都能充當有效的「質子海綿」(proton sponge)體.這種聚陽離子能將各種報告基因轉入各種種屬細胞,其效果好於脂質聚醯胺,經進一步的改性後,其轉染性能好於樹枝狀聚合物,而且它的細胞毒性低.大量實驗證明,PEI是非常有希望的基因治療載體.目前在設計更複雜的基因載體時,PEI經常做為核心組成成分。

 

    線型PEI（Line PEI,LPEI）與其衍生物用作基因轉染載體的研究比分枝狀PEI（Branched PEI,BPEI）要早一些,過去的研究認為在不考慮具體條件,LPEI/DNA轉染複合物的細胞毒性較低,有利於細胞定位,因此與BPEI相比應該轉染效率高一些.但最近研究表明BPEI的分枝度高有利於形成小的轉染複合物,從而提高轉染效率,但同時細胞毒性也增大.超高分枝的、較柔性的PEI衍生物含有額外的仲胺基和叔胺基,在染實驗中發現這種PEI的毒性低,但轉染效率卻較高。

 

    GenEscort是採用各種分枝狀和超高分枝狀的小分子PEI與各種含有生理條件下可降解鍵的交聯劑交聯,合成出的一系列高分枝的可降解的PEI衍生物.聚合物的分枝結構使得其具有較高的正電性,因此易於高效地包裹各種DNA、RNA分子及質粒形成小的納米顆粒,從而提高轉染效率,當所形成複合物進入細胞以後,其中所含的生理條件下可降解的化學鍵在細胞內水解,使交聯聚合物分解為無細胞毒性的小分子PEI,這樣結構的轉染試劑在體外應用可以獲得高的轉染效率和低的細胞毒性,其可降解性對體內應用也具有重要的意義。


 

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