乾貨| 手把手教你做細胞轉染(含操作指南)

2020-11-26 生物谷


導語


上周小魚細述了影響細胞轉染效率的三大重要因素（可查看《細胞轉染率低？小心花樣式「做死」！》的文章），然而仍有不少研究僧曾在這個坑中跌爬滾打，被摔的鼻青臉腫。說到底轉染方法太過五花八門，讓人眼花繚亂。那麼為了平安度過這道坎兒，選擇一個適合的細胞轉染方法才是至關重要的。


轉染方法大比拼


眾所周知，細胞轉染技術主要分為三大類：化學法、物理法及生物學法。但是沒有一種方法是放之四海而皆準的，即沒有任何方法適用於所有細胞和所有實驗。因而只有依據自己的實驗要求選擇理想的方法，才能獲得漂亮的實驗結果。



接下來，就對其中幾種經典轉染方法進行一一介紹。


1、DEAE-右旋糖苷法


常言道：同性相斥，異性相吸。因而，當帶正電的DEAE-右旋糖苷與核酸中帶負電的磷酸骨架相遇，妥妥的火花四射，而後會被細胞膜抱團相擁並通過細胞內吞作用迎客到家。該法可用於瞬時轉染，操作相對簡單、結果可重複，但是對細胞有一定的毒副作用，且轉染時需要血清。



2、磷酸鈣法


通常穿了「隱身衣」核酸分子在「照妖鏡」磷酸鈣的作用下可形成「肉眼可見」的磷酸鈣-DNA共沉澱，可使共沉澱中濃縮DNA分子與細胞表面結合併通過內吞作用進入細胞。該法可用於瞬時或穩定轉染。然而因其對pH、溫度和緩衝液鹽濃度的微小變化十分敏感，所得結果容易出現差異，且對許多類型的細胞培養物(尤其是原代細胞)具有細胞毒性，轉染效率較差。



3、人工脂質體法


帶正電的脂質體與核酸帶負電的磷酸基團形成複合物，進而可被細胞內吞穩定轉染/瞬時性轉染。這種方法幾乎適用於所有細胞，轉染效率高、重複型好，但轉染時需要去除血清，轉染效果隨細胞類型變化大。



4、電穿孔法


有時，細胞有些「油鹽不進」，就是不開放門戶給核酸放行，此時各位小夥伴可採用一些強硬手段—電穿孔法。此法利用高脈衝電壓破壞細胞膜電位，使得DNA 通過膜上形成的小孔導入穩定/瞬時性轉染，適用於所有類型的細胞，但細胞致死率高，DNA和細胞用量大，且需根據不同細胞類型優化電穿孔實驗條件。


其他物理基因輸送法還包括基因槍、直接顯微注射等方式。前者又稱為粒子轟擊，可將包裹著核酸的顯微重金屬顆粒告訴射入受體細胞內，適用於瞬時性轉染。該技術可需要昂貴的設備，且細胞死亡率較高。而後者則是通過精細的注射針將核酸送入胞漿中，一次只能輸送一個細胞中，適用於構建

轉基因動物

或輸送人工染色體。



5、病毒轉導法


一般，病毒介導的轉染也稱之為轉導，它為難以轉染的細胞類型提供了一種方法，可用於蛋白質過表達或抑制，是臨床研究中最常用的方法。它通過侵染宿主細胞將外源基因整合到染色體中，可用於難轉染細胞、原代細胞的穩定性轉染。



細胞轉染操作指南：以脂質體為例


1.轉染前


首先，準備細胞、質粒和實驗所需試劑。細胞最好取實驗室裡已經驗證的易轉染

細胞株

，如COS-1/Hela/CHO-K1細胞，同時實驗前要重新復甦一株低傳代細胞來確保該

細胞株

未被其他細胞和微生物汙染。


選擇表達質粒

載體

如β-gal

載體

，GFP

載體

等時，要先確保該質粒能在所選的細胞系中表達良好。同時質粒純化時要注意純化過程中勿使雙鏈斷裂以及無核酸酶和內毒素汙染。


同時準備新鮮的培養基，使用前用0.22um濾膜過濾培養基來確保培養基無汙染。細胞培養過程中勿加

抗生素

，且需要不斷監測細胞的生長情況。當細胞密度達到50-80%時，可用於細胞轉染。


2.轉染中


首先，由於不同質粒和脂質體的最佳搭配比例不同，轉染前應該做預實驗來摸索一個最佳配比。作預實驗時，按照質粒：脂質體=1：1、1：2、1：3、1：4的梯度來檢測最佳轉染比例，如下表所示。



同時也需要設立對照實驗，如試劑對照：僅加入轉染試劑，可確定轉染試劑對細胞毒性。DNA對照：僅加入DNA，確定製備DNA的質量是否對細胞存在影響。空白對照：用空載體製備轉染試劑複合物（建議3：1的比例），確定轉染後細胞生理或功能的變化是源於目標基因，還是源於轉染過程本身。


其次，在正式實驗中，需要小心輕柔將lipo2000加到培養基中並輕輕混勻，避免暴力吹打，使得脂質體失效。轉染時各種培養皿添加的質粒和脂質體參考量見下表：



3.轉染後


首先，轉染24h後需要觀察轉染過程對細胞毒性情況，如果毒性較高，可能是由以下原因造成的：


*初期細胞接種濃度太低


*轉染複合物加入量過高，因為不同細胞對轉染的敏感度不同


*轉染後6小時需更換培養基，一是lipo2000具有一定毒性，二是培養基需要更換成有血清培養基。


其次，轉染後需要對轉染效率進行檢測，比如觀察轉染後細胞螢光情況、qPCR驗證或WB檢測敲減或者過表達蛋白。


*對於β-gal表達載體：可用β-gal染色試劑盒進行細胞染色並觀察細胞。轉染效率高的細胞在染色孵育後3-4h即可觀察到，轉染效率低的細胞則需要更長的孵育時間。


*對於GFP表達載體：螢光顯微鏡下觀察細胞。如果細胞能在顯微鏡下被觀察到，至少需要有104-105拷貝的GFP蛋白表達，表達太弱的細胞無法鏡檢。GFP表達情況也能使用流式細胞儀進行檢測，同時可加入PI進行染色以監測死細胞情況。


最後，若是轉染後發現轉染效率不高，可以通過兩種方法增強轉染效率。


（1）復轉染，即轉染後12-24小時再次進行轉染，前提是該細胞對脂質體的耐受性較好，轉染後細胞死亡數較少。


（2）通過藥篩來殺死未轉入成功的細胞。前提是該質粒帶有

抗生素

抗性的基因。（

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附錄：轉染中可參考的數據



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