利用病毒傳遞系統來轉導細胞在基因和蛋白質研究已變得很常見，慢病毒載體就可以穩定地表達目的基因。慢病毒，屬於逆轉錄病毒，它的主要作用機制是表達逆轉錄酶，將病毒RNA轉化為雙鏈DNA，整合酶再將病毒DNA插入宿主DNA，然後和宿主細胞一起進行分裂。慢病毒可以感染分裂細胞和非分裂細胞，如有絲分裂後的細胞。
一、概述
我們都知道，病毒缺乏複製機制，所以需要細胞來「存活」。慢病毒載體傳遞系統最重要的一個方面就是慢病毒載體的生產，通常在HEK293細胞(或一些變種)。
例如，慢病毒傳遞系統的一個常見用途是插入短的髮夾RNAs (shRNA)，用於RNAi介導的基因敲除。shRNA首先被包裝成慢病毒載體，然後轉染HEK293細胞。轉染的細胞孵育約3天，此間慢病毒複製和產生慢病毒顆粒，然後收穫，評價滴度，再轉化目標細胞。
二、關於轉染HEK293細胞
維持細胞的良好狀態是必要的。HEK293細胞生長迅速，胰蛋白酶化速度快，所以不要在胰蛋白酶中長時間孵育，否則可能會有大量細胞死亡。解凍後的細胞應至少傳代兩次，然後接種進行轉導實驗。並且要非常輕柔地處理，因為細胞很容易分離。在轉染實驗中，HEK293細胞接種於約5*10^6細胞/10cm培養皿中，接種後次日細胞約40-50%融合。
三、為轉導做好準備
將慢病毒載體質粒連同病毒包裝載體打包成脂質體，並將其遞送到HEK293細胞中。在實驗的包裝部分使用無血清培養基是非常重要的。無血清培養基促進DNA與陽離子脂質體複合物的形成，提高轉染效率。
有了轉染複合物，含shRNA、包裝質粒和脂質體，就可以進行包裝了。傾斜帶有HEK293細胞的培養皿，將轉染混合物逐滴加入收集的培養基中。在添加轉染混合物時要謹慎，溫柔操作。一旦加入溶液，小心地旋轉平板，使培養基混合，將轉染混合物均勻地分配到細胞上。
在無血清培養基中培養5-8小時。孵育後，輕輕抽吸培養基(這將包含沒有轉染HEK293細胞的含有質粒的脂質體)，並在培養皿的一側加入10 ml完全培養基，這樣細胞就不會分離。HEK293細胞將shRNA包裹成病毒顆粒並釋放到培養基中。
此時，培養基中會充滿病毒顆粒，因此在搬運時應穿戴適當的防護用品。48小時後收集培養基(病毒顆粒)，將10 ml新鮮的完全培養基加入同一培養皿中。72小時後再次收集培養基，與48小時收集的結合。通過0.45微米的過濾器對收集到的混合培養基進行消毒，以允許病毒通過。凍融循環會降低病毒的效力，所以最好進行分裝。病毒可以在4℃下保存一到兩個月，長期保存在-20℃。經常使用漂白劑處理在病毒產生過程中使用的吸管頭和平板。
四、病毒進入細胞
通常，測定病毒的效價非常重要，方便確定實驗濃度。一個良好的敲除，至少50%的細胞轉導病毒。用適當的分析方法檢查細胞是否定點敲除，通常涉及到Western Blot。
1.使用相同比例的病毒和細胞獲得50%的轉導。在一個15ml的試管中，用5ml的完全培養基重懸約200萬個細胞(10cm培養皿的四分之一)。在同一試管中，加入2.5ml病毒和15ug/ml的聚凝胺。聚凝胺通過中和病毒顆粒和細胞膜之間的電荷來提高轉導效率。
2輕輕混勻，將細胞放入一個10釐米的新培養皿中。24小時後，換到沒有病毒的新鮮完全培養基中。如果shRNA構建物含有螢光標記物，可以檢測轉染48小時後檢測是否整合成功；如果沒有，繼續進行抗生素選擇48小時。
文章來源：每日生物評論
歡迎關注微信公眾號：每日生物評論，或Bio-review
用最專業的精神，開放性的思維，與你一起探索行業走向，快速了解這個領域！