懸浮培養HEK293細胞包裝病毒載體的過程優化

2021-01-16 Cytiva思拓凡

2、實驗結果：

在轉染時活細胞密度為1×106cells/ml條件下，結果顯示一組獨特的參數，轉基因質粒的濃度更高，較短的孵育時間，丁酸鈉的添加等條件，詳述如下：

1) DNA濃度：1 µg/uL，藉由案例1可知，高細胞密度下，可降低此值；

2) PEI/DNA比例：2，較高的比例並不能帶來更好的病毒滴度；

3) 轉染體積：5%，過高過低的轉染體積均不利於轉染效率；

4) 轉染複合物孵育時間：20 min，過長的孵育時間，將使複合物體積變大，不利於其進入細胞；

5) 溫度：37 oC;

6) DNA比例：Rep/cap:helper:transgen plasmid=1:1:2

7) 轉染後丁酸鈉的添加：5 mM，過多的丁酸鈉會造成細胞活率的降低，但可以顯著提高病毒滴度。

相關焦點

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    關注我們，為您的科研路提速　　293細胞系是原代人胚腎細胞轉染5型腺病毒(Ad 5) DNA的永生化細胞，表達轉染的腺病毒5的基因。293細胞比較容易轉染，是一個很常用的表達研究外源基因的細胞株。293細胞的一個衍生株：293T/17的轉染效率更高，成為廣大研究者研究基因功能的一個強大工具。293細胞的缺陷是生長過程中貼壁強度比較小。所以在實驗過程中容易流失，從而影響實驗結果。如果一個實驗室新得到的293細胞是郵寄得到的並且細胞在培養瓶中，就需要讓細胞沉降幾天時間，因為大量細胞會漂浮在培養液裡。
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    動物細胞轉染技術多樣，包括化學法、病毒轉導、傳統電穿孔法等。化學轉染磷酸鈣沉澱法、DEAE-葡聚糖、脂質體轉染等，操作簡單快捷，但大部分原代細胞、幹細胞、細胞系轉染效率低下，僅有少數貼壁細胞系轉染較高效，批次間重複性差。使用慢病毒、腺病毒、逆轉錄病毒的病毒轉導技術，雖然轉染效率高，但轉染底物有局限，轉染的基因片段大小需<10kb。
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  • 動物細胞培養及外源基因的導入
    針對培養細胞的外源DNA導入已發展出多種技術，其中常用的有磷酸鈣介導的轉染，DEAE-葡聚糖介導的轉染，脂質體介導的轉染，電穿孔法等。這4種方法除DEAE-葡聚糖法外，均可用於暫時性轉染和永久性轉染。但它們有各自適用的細胞系。培養的細胞不同，其在攝取和表達外源DNA的能力上可能存在幾個數量級的差異。因此針對細胞系優化並比較幾種不同方法的效率很重要。
  • 提高基於杆狀病毒的AAV的生產方法及相關系統的可擴展性與生物安全性
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  • sf9昆蟲細胞的培養
    表達水平高（特別是細胞內蛋白），較快的生長速度，有效的蛋白摺疊，廣泛的翻譯後修飾，糖基化與哺乳動物細胞類似，相對容易地酶促的去糖基化（對於蛋白結構測定有利），在V LPs表達中被廣泛使用。1.於重組病毒的分離是通過藍白斑篩選，不存在野生型和非重組型病毒汙染的問題，因此不需要傳統繁瑣的空斑分析來純化重組病毒。
  • 個中之最,這樣的腺病毒及其載體疫苗...
    由於腺病毒具有線性的雙鏈DNA，易於進行基因操作；基因組容量大；與其他載體相比載體高表達，且表達時間長久；能同時誘導體液免疫和細胞免疫反應；無需添加佐劑；安全性好；容易製備；可經肌肉、口服甚至鼻腔吸入免疫，因此被作為新型疫苗的理想載體，廣泛應用於各種疫苗研究，包括針對愛滋病病毒、流感病毒、伊波拉病毒、寨卡病毒和瘧疾、狂犬病、前列腺癌、