實驗大揭秘:轉染是如何進行的

2021-01-19 生物谷

 

轉染是將核酸導入真核細胞中的過程，是細胞生物學、基因表達和基因抑制實驗中的關鍵步驟。轉染是採用除病毒感染外的其他方法將核酸(DNA或RNA)人工導入細胞的過程。採用各種化學、生物學或物理方法導入外源性核酸會改變細胞的特性，從而實現細胞基因功能和蛋白質表達研究。


轉染後，導入的核酸可以瞬時性地存在於細胞內，只表達一段時間且不會複製，也可以穩定地整合至受體基因組內，隨著宿主基因組的複製而複製。



轉染的目的


轉染的兩個主要目的是生成重組蛋白，或特異性地提升或抑制轉染細胞中的基因表達。因此，轉染是一種功能強大的分析工具，可用於基因或基因產物的功能和調控研究，用於生成轉基因生物，並用作基因治療方法。


基因表達

轉染最常通過使用質粒載體或mRNA在培養細胞(或動物模型)中表達目的蛋白。利用真核細胞中的蛋白表達可以生成經過適當摺疊和翻譯後修飾的重組蛋白。另外，將帶有可檢測的標記物及其他修飾的蛋白質導入細胞，可用於啟動子和增強子序列或蛋白: 蛋白相互作用的研究。


此外，根據轉染策略的不同，轉染還可應用於各種形式的生物生產。例如，導入重編程轉錄因子可以生成誘導多能性幹細胞(iPSC)。另一方面，穩定轉染提供了不同治療分子的生物生產方法。


基因抑制

轉染的另一個常用用途是通過RNA幹擾(RNAi)抑制特定蛋白質的表達。在哺乳動物細胞中，利用內源性表達的非編碼RNA，以microRNA (miRNA)的形式-來源於雙鏈RNA (dsRNA)前體-完成RNAi。前體被加工成成熟miRNA，成為RNA誘導的沉默複合物(RISC)的一部分，抑制互補靶mRNA的翻譯。


載體系統表達miRNA前體或短髮夾RNA (shRNA)前體，它們通過內源性機制分別生成miRNA或shRNA，然後抑制基因表達。利用這些系統可以實現重組體的穩定轉染，並允許前體分子的誘導型表達。


化學合成的短/小分子幹擾RNA (siRNA)還可以整合形成RISC，通過靶向互補mRNA (降解)誘導基因沉默。siRNA修飾有助於防止脫靶效應，還可以確保dsRNA的活性鏈整合至RISC中。


轉染類型


將核酸導入細胞的生物、化學和物理方法有很多種。並非所有方法均適用於所有的細胞類型和實驗應用，不同方法的轉染效率、細胞毒性、對正常生理學的影響和基因表達水平各異。但是，所有轉染策略均可分為兩大類，其中一些導入核酸在細胞中存在一段時間(瞬時轉染)，而另一些則長時間存在於細胞中，並被傳遞至轉染細胞的子代(穩定轉染)。

轉染小貼士1. 瞬時轉染和穩定轉染 

細胞膜是由磷脂雙分子層和鑲嵌蛋白組成的，帶有淨負電荷。因此，它是大分子無法通過的障礙，如同樣帶有負電荷的DNA和RNA的磷酸骨架。為了讓核酸通過細胞膜，研究人員開發出了各種技術，利用不同的方法-從使用化學物質和包被核酸的載體分子進行中和到使用物理方法在細胞膜上開孔，將DNA直接運輸到細胞內。


目前可用的轉染技術主要分為三大類：化學方法，使用載體分子中和或將陽性電荷傳遞至帶負電的核酸上；生物學方法，採用已經過遺傳學改造的病毒轉移非病毒基因至細胞內(又稱為轉導)；及物理方法，將核酸直接導入細胞質或細胞核內。但是，沒有一種方法可以適用於所有細胞和所有實驗。必須根據您的細胞類型和實驗要求選擇理想的方法，必須具有高轉染效率、低血細胞毒性、對正常生理學的影響最小，且使用簡單、可重複。


接下來我們就來看看最常用的基因輸送技術——陽離子脂質體介導的基因輸送


陽離子脂質體介導的輸送是一種快速、簡單且重複性好的方法，可方便地將DNA、RNA、siRNA或寡核苷酸轉入真核細胞內。它可對多種細胞類型實現高效轉染，包括貼壁細胞、懸浮細胞、昆蟲細胞和原代培養細胞。


陽離子脂質體介導的轉染的優勢在於能夠高效地轉染各種細胞系，適用於高通量篩選，且能夠導入各種大小的DNA、RNA和蛋白質。此外，該方法可用於穩定和瞬時表達，與其他化學方法不同，它可以實現動物和人體內DNA和RNA轉移。


圖1. 陽離子脂質體介導的輸送機制

 

轉染小貼士2. 陽離子脂質體介導的工作流程

 

在選擇轉染試劑時，您必須考慮您想要導入的載體(DNA、RNA或蛋白質)，以及您想要轉染的細胞類型，因為您選擇的轉染試劑會對轉染結果產生極大的影響。下表列出了賽默飛提供的各種陽離子脂質體轉染試劑的主要特點和應用。如需了解各轉染試劑和針對各細胞系的優化轉染實驗方案，請登錄www.thermofisher.com/transfection。


賽默飛提供了各種陽離子脂質體介導的轉染試劑，可以將DNA、RNA、siRNA或寡核苷酸高效導入各種細胞內。


Lipofectamine™ 3000——最具性價比、能夠處理最難處理的細胞


在最難處理的細胞中將轉染效率提高10倍，適用於廣泛的細胞類型，對細胞作用溫和，可提供出眾的轉染性能和可重複的結果。


Lipofectamine 2000——最經典、文獻引用最多的轉染試劑


實驗方案簡單，適用於多種細胞系，易於針對廣泛的細胞類型進行優化，轉染後無需換液。


Lipofectamine RNAiMAX——輸送siRNA和miRNA進行基因抑制試驗的金標準


在廣泛的細胞系中（包括常見細胞類型、幹細胞、原代細胞以及歷來難轉染的細胞類型）提供簡便、高效的RNA輸送效果，細胞毒性低。


Lipofectamine MessengerMAX——專用於mRNA輸送的卓越轉染試劑


基於mRNA的轉染，可實現更快速的蛋白表達，無基因組整合風險。特別針對神經元和原代細胞類型，轉染效率可達DNA試劑的5倍。


Lipofectamine Stem——專用於幹細胞轉染的卓越轉染試劑


專用於幹細胞的轉染試劑，在 PSC 和 NSC 中可實現高達 80% 的轉染效率，在 MSC 中可實現高達 45% 的轉染效率，對細胞作用溫和，能夠共轉染DNA、RNA和Cas9蛋白。


Lipofectamine CRISPRMAX™ Cas9——首款針對CRISPR-Cas9蛋白輸送的的轉染試劑


對細胞作用溫和，剪切效率高達85%。


另外，在轉染實驗中，Gibco™ Opti-MEM 減血清培養基可以用於稀釋轉染試劑和核酸。在含血清培養基中生長的大多數細胞可以轉移到Opti-MEM培養基中，降低至少50%的血清添加量，獲得更高的轉染效率。Gibco Opti-MEM非常適用於陽離子脂質體轉染，特別是Lipofectamine轉染試劑。

 

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文末小調查

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  • 「轉染」 可以不是一件讓你頭痛的事
    Lipofectamine™ 3000, Lipofectamine™ 2000和 Lipofectamine™ LTX/PLUS能夠在70-90％的細胞匯合度時展現優異的轉染性能，而匯合度低於這一數值時，則可能觀察到細胞毒性。Lipofectamine™ RNAiMAX在60-80％的細胞匯合度時效果最佳。傳代次數可能會影響轉染實驗。我們推薦一致地傳代和接種細胞。
  • 質粒轉染-Lipofectamine 3000
    轉染後無需去除轉染複合物或者更換/ 添加培養基。3.  Lipofectamine™ 3000 試劑用量各有不同。測試推薦的兩種濃度的Lipofectamine™ 3000 試劑，以確定最佳用量，開始新的轉染。四、實驗方案大綱A. 接種細胞，使其在轉染時達到70–90% 匯合度。B.
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