各種轉染試劑的中文轉染方法

各種轉染試劑的中文轉染方法

中國教育裝備採購網 2015/4/30 9:17:05 圍觀256次 我要分享

FuGENE6（Roche）轉染步驟：轉染前一天將細胞分至培養板，轉染當天細胞應50-80％融合。將細胞以1-3×105/2 ml接種於6孔板後孵育過夜將達到如此密度。將FuGENE6 Reagent在室溫孵育10-15分鐘。使用之前將FuGENE6顛倒混勻一下。1.在PCR管中加入不含血清和雙抗的營養液以稀釋FuGENE6，直至總體積到100 ul。2.將3-6 ul FuGENE6 Reagent直接加入營養液，輕彈管壁混合。3.加入1-2 ug的DNA溶液（0.02－2.0 ug/ul），輕彈管壁混合。4.室溫孵育20分鐘。5.將6孔板中的舊營養液吸出，加入約1 ml不含血清和雙抗的營養液洗滌一次，再加入2 ml不含血清和雙抗的營養液。6.將轉染複合物加入細胞，混勻使之均勻分布。7.3-8小時後，加入血清或換成含血清的營養液。 Lipofectamine 2000(Invitrogen)轉染試劑轉染步驟（6孔板）：1.轉染前一天，胰酶消化細胞並計數，細胞鋪板，使其在轉染日密度為90-95％。細胞鋪板在2 ml含血清，不含抗生素的正常生長的培養基中。2.對於每孔細胞，使用250 ul無血清培養基（如OPTI-MEM I培養基）稀釋4.0 ugDNA，輕輕混勻。3.使用前將Lipofectamine 2000轉染試劑輕輕混勻，用250 ul無血清培養基（如OPTI-MEM I培養基）稀釋10 ul Lipofectamine 2000轉染試劑，輕輕混勻。Lipofectamine 2000稀釋後，在5分鐘內同稀釋的DNA混合（<30分鐘）。NOTE：若使用DMEM培養基，則需在5分鐘內同稀釋的DNA混合。4.混合稀釋的DNA（第二步）和稀釋的Lipofectamine 2000（第三步）。室溫放置20分鐘。5.（optional）將6孔板中的舊營養液吸出，用無血清培養基清洗兩次。加入2 ml無血清配養基。6.直接將複合物加入到每孔中，搖動培養板，輕輕混勻。7.在37℃，5％CO2中保溫24-48小時。無需去掉複合物或更換培養基。或者在4-5小時後更換培養生長基也不會降低轉染活性。8.在細胞中加入複合物24-72小時後，分析細胞抽提物或進行原位細胞染色，檢測報告基因活性。這依賴於細胞類型和啟動子活性。對穩定表達，在開始轉染一天後將細胞傳代至新鮮培養基中，兩天後加入篩選抗生素。進行穩定表達需要數天或數周。貼壁細胞的穩定轉染：轉染後24小時，將細胞以≥1:10的比例傳代至新鮮培養基中，次日加入選擇性培養基。 Lipofectamine 2000轉染試劑轉染步驟（24孔板）：1.轉染前一天，胰酶消化細胞並計數（0.5-2×105），細胞鋪板，使其在轉染日密度為90-95％。細胞鋪板在0.5 ml含血清，不含抗生素的正常生長的培養基中。2.對於每孔細胞，使用50 ul無血清培養基（如OPTI-MEM I培養基）稀釋0.8-1.0 ugDNA，輕輕混勻。3.使用前將Lipofectamine 2000轉染試劑輕輕混勻，用50ul無血清培養基（如OPTI-MEM I培養基）稀釋1-3 ul Lipofectamine 2000轉染試劑，輕輕混勻。Lipofectamine 2000稀釋後，在5分鐘內同稀釋的DNA混合（<30分鐘）。NOTE：若使用DMEM培養基，則需在5分鐘內同稀釋的DNA混合。4.混合稀釋的DNA（第二步）和稀釋的Lipofectamine 2000（第三步）。室溫放置20分鐘。5.（optional）將24孔板中的舊營養液吸出，用無血清培養基清洗兩次。加入0.5ml無血清配養基。6.直接將複合物加入到每孔中，搖動培養板，輕輕混勻。7.在37℃，5％CO2中保溫24-48小時。無需去掉複合物或更換培養基。或者在4-5小時後更換培養生長基也不會降低轉染活性。8.在細胞中加入複合物24-72小時後，分析細胞抽提物或進行原位細胞染色，檢測報告基因活性。這依賴於細胞類型和啟動子活性。對穩定表達，在開始轉染一天後將細胞傳代至新鮮培養基中，兩天後加入篩選抗生素。進行穩定表達需要數天或數周。貼壁細胞的穩定轉染：轉染後24小時，將細胞以≥1:10的比例傳代至新鮮培養基中，次日加入選擇性培養基。 Effectene Transfection Reagent(Qiagen) 轉染步驟：以下步驟適用於在6孔培養板中轉染貼壁細胞。開始時，每6孔培養板使用0.4 ug DNA。儘管DNA的量看起來很少，但已足夠用於轉染。如果想獲得最高的轉染效率，對每種細胞系的轉染條件都要進行優化。1.轉染前一天，用5ml含血清和抗生素的培養基分裝使每6孔培養板含2-8×105的細胞（根據細胞類型而定）。2.在細胞的正常培養條件下培養（通常37℃和5％CO2）。轉染當天細胞應40-80％融合。3.轉染時，用DNA濃縮緩衝液（EC Buffer）稀釋1 ug DNA至100 ul總體積（DNA用pH 7-8的TE Buffer溶解，DNA最低濃度：0.1ug/ul）。加入3.2 ul Enhancer，渦旋1s以混合溶液。重要：請保持DNA與Enhancer比例恆定。注意：質粒DNA的質量會顯著影響幾個轉染參數如轉染效率、細胞增殖和細胞毒性、以及對於結果的解釋。因此，只應該使用最高純度的DNA。使用HiSpeed，QIAfilter和QIAGEN Plasmid Kits抽提純化的質粒適合於大多數細胞系的轉染。要獲得最好的重複性和最好的結果，我們推薦使用Endofree Plasmid Kit，該試劑盒可以快速有效地在質粒純化過程中去除細菌內毒素，從而獲得最佳的轉染結果。4.室溫（15-25℃）孵育2-5分鐘，離心（spin down）幾秒鐘以從管頂去除液滴。5.向DNA-Enhance混合液中加入10ul Effectene Transfection Reagent，反覆吸取5次或渦旋10秒鐘以混合。注意：沒必要一直把Effectene Reagent置於冰上。在室溫中放置10-15分鐘不會改變它的穩定性。6.室溫下（15-25℃）孵育5-10分鐘以形成轉染複合物。7.孵育過程中，從培養板上輕柔地吸出培養液，用4 ml PBS洗滌一次細胞。加入1.6 ml新鮮培養液（可以包含血清和抗生素）到細胞中。8.加入0.6 ml培養液（可以包含血清和抗生素）至包含轉染轉染複合物的EP管中。吸取兩次以混合，立即將轉染複合物drop-wise加入6孔培養板的細胞中。輕搖培養板使轉染複合物分布均勻。9.將細胞與轉染複合物在它們的正常培養條件下孵育適當的時間直至轉染基因表達。孵育時間和由所採用的實驗和所使用的基因決定。 Optional: 大多數情況下，不需去除轉染複合物。然而，如果觀察到細胞毒性，則需在轉染後6-18小時移除Effectene-DNA混合物，用PBS洗滌一次細胞，然後加入5 ml新鮮細胞培養液。 10.瞬時轉染時，進一步試驗分析轉染基因的表達。 轉染β-gal 或 cat 報告基因的重組子常在轉染後孵育24-48小時以使轉染基因的表達最大化。 穩定轉染時，在轉染後24-48小時，將細胞以1:5~1:10傳代至合適的選擇性培養基中。保持細胞在選擇性培養基中直至克隆出現。注意：我們推薦對每一細胞系和使用的抗生素建立一個致死曲線（劑量-反應曲線）。但是一定要記住致死曲線受細胞密度的影響。 以下步驟有時是必須的：將轉染的細胞置於它們正常的培養液（如：不含選擇性抗生素的培養液），然後孵育1-2天，然後再加入選擇性培養液。 Superfect Transfection Reagent(Qiagen) 轉染步驟：以下步驟適用於在6孔培養板中轉染貼壁細胞。如果想獲得最高的轉染效率，對每種細胞系的轉染條件都要進行優化。1.轉染前一天，用含血清和抗生素的培養基分裝使每6孔培養板含2-8×105的細胞（根據細胞類型而定）。2.在細胞的正常培養條件下培養（通常37℃和5％CO2）。轉染當天細胞應40-80％融合。3.轉染時，用無血清培養基稀釋2 ug DNA至100 ul總體積（DNA用pH 7-8的TE Buffer溶解，DNA最低濃度：0.1 ug/ul）。混合，離心幾秒鐘以從管頂去除液滴。 注意：質粒DNA的質量會顯著影響幾個轉染參數如轉染效率、細胞增殖和細胞毒性、以及對於結果的解釋。因此，只應該使用最高純度的DNA。使用HiSpeed，QIAfilter和QIAGEN Plasmid Kits抽提純化的質粒適合於大多數細胞系的轉染。要獲得最好的重複性和最好的結果，我們推薦使用Endofree Plasmid Kit，該試劑盒可以快速有效地在質粒純化過程中去除細菌內毒素，從而獲得最佳的轉染結果。 4.向DNA稀釋液中加入10 ul Superfect Transfection Reagent，反覆吸取5次或渦旋10秒鐘以混合。注意：沒必要一直把Superfect Reagent置於冰上。在室溫中放置10-15分鐘不會改變它的穩定性。5.室溫下（15-25℃）孵育5-10分鐘以形成轉染複合物。6.孵育過程中，從培養板上輕柔地吸出培養液，用2ml PBS洗滌一次細胞。7.加入600 ul培養液（包含血清和抗生素）至包含轉染轉染複合物的EP管中。吹打兩次以混合，立即將轉染複合物加入6孔培養板的細胞中。輕搖培養板使轉染複合物分布均勻。8.將細胞與轉染複合物在它們的正常培養條件下孵育2-3小時。9.小心移除Superfect-DNA混合物，用2 mlPBS洗滌3-4次細胞10.加入新鮮的正常培養基，孵育24-48小時。11.瞬時轉染時，進一步試驗分析轉染基因的表達。 轉染β-gal 或 cat 報告基因的重組子常在轉染後孵育24-48小時以使轉染基因的表達最大化。 穩定轉染時，在轉染後24-48小時，將細胞以1:10~1:15傳代至合適的選擇性培養基中。保持細胞在選擇性培養基中直至克隆出現。 注意：我們推薦對每一細胞系和使用的抗生素建立一個致死曲線（劑量-反應曲線）。但是一定要記住致死曲線受細胞密度的影響。 以下步驟有時是必須的：將轉染的細胞置於它們正常的培養液（如：不含選擇性抗生素的培養液），然後孵育1-2天，然後再加入選擇性培養液。

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