CRISPR-Cas9是一種細菌獲得性免疫，用於降解入侵的外源DNA。CRISPRRNA (crRNA) 與轉錄激活crRNA(Trans-activating crRNA，tracrRNA)退火形成的複合物能特異性識別與其互補的基因組序列，引導Cas9核酸內切酶在目的片段生成DNA雙鏈斷裂。
通過基因工程手段對crRNA和tracrRNA進行改造，將其連接在一起得到sgRNA(single guideRNA)。通過將表達sgRNA的原件與表達Cas9的原件相連接，得到可以同時表達兩者的質粒，將其轉染細胞，便能夠對目的基因進行基因操作，在PAM(5』-NGG) 上遊~3bp進行切割，如下圖所示。
因此本實驗的關鍵步驟是以PAM為標誌，在選定範圍內的正鏈和負鏈上尋找可能的靶序列（20bp+3bp）。
操作詳細流程
以TMEM187（human）為例進行設計1、利用以下兩個網站：
NCBI：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
UCSC：http://genome.ucsc.edu/
2.找基因：
打開NCBI主頁→下拉框中選擇Gene →輸入目的基因名稱或ID號→點擊Search→選擇對應的物種。
3.找轉錄本：
在mRNA and Protein(s)列表中，找到該基因所有的轉錄本，點擊進入，可以查看該轉錄本的CDS序列,用Snapgene找出所有轉錄本的公共區域（上期已介紹Snapgene序列比對方法）。
4.找基因組全序列：
打開UCSC網頁→點擊BLAT，輸入目的基因序列公共的CDS序列→選擇基因所屬的物種信息和最新上傳的數據→提交後點擊匹配度100%的details打開→找出該序列中外顯子和內含子的位置，儘量在5』端的外顯子區域設計（至少應在目的蛋白的主要結構域上遊）。
1.利用的以下網站：
張峰最新設計網站：https://zlab.bio/guide-design-resources
2.點擊CRISPOR進入設計頁面→在Sequence name (optional)填寫基因名稱→Clear Box輸入待設計的的序類（一般選擇第一個外顯子進行設計，保留5』端前部分內含子序列）→在Select a genome下拉框處選擇最新的對應物種資料庫。
3.根據score的高低選取合適的Guide序列，score的高低並不代表敲除效率的高低，所以為提高敲除的成功率，一般選擇2-3個Guide序列，構建2-3個敲除載體。
因為實驗還需要對該區域進行基因組測序，在進行gRNA設計時，也應儘量避免一些高GC區域。
得到一個成功敲除的細胞株預計需要2個月左右時間，gRNA設計是其中一個較為的重要的步驟之一，除此以外，細胞的轉染效率、單克隆能力，目的基因序列拷貝數、基因缺失對細胞的影響等都是決定我們能否得到一個純合子細胞株的重要因素。
吉銳生物成功完成了上百種細胞株構建案例，可以快速、準確、高效的完成基因敲除/沉默/過表達實驗得到穩轉細胞株。同時我們擁有完善的 CRISPR/Cas9 載體系統，包括：動物敲除載體pGK系列；植物敲除載體pP1C系列、基因敲除檢測試劑盒Cruiser® Enzyme、敲除載體庫等。