1. sgRNA的構建
1.1靶基因序列的確定
1.打開NCBI：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/，查詢靶基因的核酸序列（這裡以wnt1為例說明），輸入wnt1。
2. 找到對應的基因序列，點擊,獲得的頁面找到mRNA sequences區域，選擇帶NM的編號。
3. 進入頁面後，找到CDS區域，點擊CCDS，複製基因序列到Word文檔中備用，即獲得靶基因序列。
1.2 sgRNA序列在線設計
1.打開網頁：http://crispr.mit.edu/，在輸入框中輸入wnt1和郵箱，同時選擇uniquegenomicregion(23-500nt)選項，再將wnt1基因的序列複製到sequence輸入框（注意：只是別同一外顯子區域，不能跨區域添加，序列長度不能大於250bp，對於長靶基因序列可分段進行）。
2.獲得如下頁面，點擊紅色標記區域即可獲得sgRNA設計所需的序列，一般選擇分值高於60的序列，複製前6個分值高的所需序列於Excel表中，備用。
3. 向兩條鏈上添加粘性末端如下圖，然後將設計好的序列送往公司合成。
CACCgTGCTACGCTGCTGCTGGCGC
AAACCGCGGTCGTCGTCGCATCGTc
1.3兩條sgRNA的設計
1.在獲得sgRNA設計結果頁面點擊Nickaseanalysis。
2.進入頁面後，可以獲得兩條sgRNA對應的分數，選擇單個sgRNA分值大於60，quality值為high的兩條序列，即為需要的序列，分別將兩條序列保存在Excel表中。
3.相同的方法獲得反義鏈及所需要送公司合成的序列。
1.4 sgRNA的構建及鑑定
1. 退火形成粘性末端，反應體系。
2. 載體線性化，這裡我們以PX458載體說明，反應體系如下圖，將反應體系電泳，切膠回收。
3. DNA連接，將sgRNA和載體連反應，反應體系如圖，室溫孵化10min。
3. 重組質粒的轉化
1. 將感受態細胞解凍，混勻。
2. 加入10μl上述轉化後的DNA於50μl的感受態細胞中，混勻，冰上靜置30min。
3. 42℃熱激90s，迅速放入冰中2-3min。
4. 將將菌液塗於事先備好的LB培養基上，37℃過夜培養。
5. 挑取單克隆，提取質粒，測序。
4. 轉染
1. 吸取97μl無血清和抗生素的DMEM培養基到無菌的1.5ml離心管中，加入3μl轉染試劑PEI並吹打混勻，室溫5min。
2. 向上述混合液中加入1μg質粒DNA混勻，室溫放置15min。
3. 將混合液加入細胞培養盤混勻。37℃培養。
4. 4-6小時更換新的培養基。