第三節 目的序列與載體的連接

2020-11-23 生物谷

第三節　目的序列與載體的連接

　　將目的基因或序列插入載體，主要靠DNA連接酶和雙鏈DNA粘末端單鏈序列互補結合的配合使用。有以下主要的方式。

　　一、粘性末端連接

　　如果目的序列兩端有與載體上相同的限制性核酸內切酶位點，則同一限制酶切開產生的粘末端，在降低溫度退火時，能重新互補結合，在DNA連接酶催化下，目的序列就與載體DNA鏈相連接（見圖20-5）。

圖20-5　同一限制酶切割DNA粘性末端的連接

　　不同的限制性內切酶切，如果產生的DNA的粘末端相同，也同樣可用此法連接，如識別6bp序列的BamHⅠ和識別4bp序列的Sau3aⅠ切割DNA後都產生5』突出粘性末端GATC，可以互補結合連接。

　　如果在連接的兩個DNA片段沒有能互補的粘性末端，可用末湍核苷酸轉移酶催化脫氨單核苷酸添加DNA的3』末端，例如一般DNA3』端加上polyG，另一股DNA加上polyC，這樣人工在DNA兩端做出能互補的共核苷酸多聚物粘性末端，退炎後能結合連接（圖20-6），這樣方法稱為同聚物加尾法。

圖20-6 同聚物加尾連拉法

　　對平末端的DNA，也可先連上人工設計合成的脫氧寡核苷酸雙連結頭，使DNA末端產生新的限制內切酶位點，經內切酶割後，即可按粘性末端相連（圖20-7）。

圖20-7　人工接頭連接法

　　二、平末端連接

　　T4DNA連接酶也能催化限制性內切酶切割產生DNA平末端的連接。如果目的序列和載體上沒有相同的限制性內切酶位點可供利用，用不同的限制性內切酶切割後的粘性末端不能互補結合，則可用適當的酶將DNA突出的末端削平或補齊成平末端，再用T4DNA連接酶連接，但平末端連接要比粘性末端連接的效率低得多。

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