第四節 目的基因序列的來源和分離
一、基因組DNA文庫
從生物組織細胞提取出全部DNA，用物理方法（超聲波、攪拌剪力等）或酶法（限制性核酸內切酶的不完全酶解）將DNA降解成預期大小的片段，然後將這些片段與適當的載體（常用噬菌體、粘粒或YAC載體）連接，轉入受體細菌或細胞，這樣每一個細胞接受了含有一個基因組DNA片段與載體連接的重組DNA分子，而且可以繁殖擴增，許多細胞一起組成一個含有基因組各DNA片段克隆的集合體，就稱為基因組DNA文庫（genomic DNA library）。如果這個文庫足夠大，能包含該生物基因組DNA全部的序列，就是該生物完整的基因組文庫，能從這文庫中釣取該生物的全部基因或DNA序列。從基因組含有生物生存、活動和繁殖的全部遺傳信息的概念出發，基因組文庫是具有生物種屬特異性的。
構建基因組文庫，再用分子雜交等技術去釣取基因克隆的方法，稱為鳥槍法或散彈射擊法，意味著從含有眾多的基因序列克隆群中去獲取目的基因或序列。當生物基因組比較小時，此法較易成功；當生物基因組很大時，構建其完整的基因組文庫就非易事，從龐大的文庫中去克隆目的基因工程量也很大。
圖20-8 基因組DNA文庫的構建
二、cDNA文庫
以mRNA為模板，經反轉錄酶催化合成DNA，則此DNA序列與mRNA互補，稱為互補DNA或cDNA。提取出組織細胞的全部mRNA，在體外反轉錄成cDNA，與適當的載體常用噬菌體或質粒載體連接後轉化受體菌，則每個細菌含有一段cDNA，並能繁殖擴增，這樣包含著細胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合稱為該組織細胞的cDNA文庫，基因組含有的基因在特定的組織細胞中只有一部分表達，而且處在不同環境條件、不同分化時期的細胞其基因表達的種類和強度也不盡相同，所以cDNA文庫具有組織細胞特異性。cDNA文庫顯然比基因組DNA文庫小得多，能夠比較容易從中篩選克隆得細胞特異表達的基因。但對真核細胞來說，從基因組DNA文庫獲得的基因與從cDNA文庫獲得的不同，基因組DNA文庫所含的是帶有含子和外顯子的基因組基因，而從cDNA文庫中獲得的是已經過剪接、去除了內含子的cDNA。
圖20-9 cDNA文庫的構建
三、聚合酶鏈式反應（PCR）
如果已經知道目的基因的序列，就能很方便地用PCR聚合酶鏈式反應，polymerase chain reaction，從基因組DNA或cDNA中獲得目的基因，可不必要經過複雜的DNA文庫構建過程。PCR是70年代中期創立的技術，其基本原理如圖20-10所示。
圖20-10 PCR基本原理示意圖
PCR反應系統包括含有目的基因或序列的DNA模板，對熱穩定的DNA聚合酶，一對脫氧寡核苷酸引物、DNA合成所需要的4種脫氧核苷三磷酸以及保證聚合酶催化反應的Mg2+及緩衝液等。人工合成引物的序列設計是PCR成功的關鍵，一般兩條引物的序列反應分別與欲獲得的雙鏈DNA兩條鏈3』端的序列互補。先升高溫度使模板DNA變性、雙鏈分開；再降低溫度退火使引物與模板DNA配對互補結合；然後升溫到聚合酶反應適宜的溫度，此時在聚合酶催化下，從引物3』羥基端開始，與模板DNA上的鹼基配對逐個加上核苷酸，合成新的DNA鏈。其後再按高溫變性、低溫退火、適溫合成三步反覆循環，新合成的DNA在下一循環中又作為模板使用，每循環一次，合成的目的序列擴增一倍，而且很快擴增的序列主要限制在所設計的一對引物規定的模板序列範圍內，一般循環30-40次，按理論計算，目的序列可擴增230-240倍，而實際上由於底物和引物的消耗，酶的失活等因素，產物量並不是始終以指數增加的，但通常實驗獲得目的序列106-108倍的擴增產物並不困難，因而PCR具有很高度的靈敏度，由於引物與模板的配對互補結合的特異的，因而PCR也具有高度的特異性。所以可以方便地用PCR在成千上萬的基因序列中獲得只有極微含量的特定目的基因或序列，PCR獲得的目的序列產物連接在適當的載體上，轉化受體細胞，經篩選就能得到目的序列的克隆。
現在PCR技術還在不斷發展，已知部分序列或未知序列的基因有的也能設計PCR來擴增和克隆，模板核酸可用雙鏈DNA，單鏈DNA，甚至RNA。由於PCR的高靈敏度和特異性，在基因診斷上有更廣泛的應用，後面的章節還要敘述。
四、人工化學合成
隨化學合成技術的發展，現在計算機控制的全自動核酸合成儀已被廣泛應用，按人們設計好的序列一次合成100-200bp長的DNA片段已不成問題。可能用這些合成的片段組合連接成完整的基因。但目前人工合成基因最大的限制是人們並未掌握怎樣的核酸序列能具有生命功能的規律，例如1kb長的DNA最通常編碼功能蛋白質的基因長度就可以有～10600種不同的序列，隨意合成的DNA絕大多數肯定是不具有生物功能或無法知道它會有什麼功能的，因而只能模仿自然界生物中已知的基因序列來合成，而化學合成這樣長的基因DNA序列，其價格遠高於用PCR法獲得基因，所以目前很少全部用化學方法去合成基因。但人工設計化學合成核酸片段作為引物、接頭等已經是分子生物學和基因工程中必不可少的、十分重要的手段。