第四節 遺傳病與腫瘤的基因診斷
從DNA水平上尋找確診遺傳病的指標或探討遺傳病和腫瘤的病因等方面，已取得很大成績，這對產前診斷，早期確診和突變基因攜帶者的檢出等都有重要意義。所用的方法大體有以下幾種。
一、分離基因進行結構分析
利用DNA離體轉化，製備探針，製備基因文庫進行篩檢，最後鑑定載體中插入DNA片段的特性等一系列技術，可以設法分離出目的基因或某一特定的DNA順序。然後通過DNA核苷酸順序分析可以弄清楚某些疾病的病因。比如，人體癌基因的分離和研究癌基因同原癌基因在DNA的結構與功能上的差別，對了解細胞癌變的機制起了很大的作用。分離目的基因或專一DNA順序更常用的是製備分子雜交探針，通過Southern印跡雜交或Northern印跡雜交等，了解某些遺傳病患者基因結構上的差別，從而找到可靠的診斷方法。比如，患者的基因是否缺失，重排以及是否存在限制性片段長度的多肽現象等。
二、DNA限制性片段多態性連鎖分析
DNA限制性片段長度多態性（restricition fragment length polymorphism, RFLPs）連鎖分析法是指由於缺失、重排或鹼基置換的結果，使DNA分子中原有的某種限制性內切酶的識別位點發生改變，或是消失或是增加，所以酶切後生成的DNA片段的長度也隨之改變。這種DNA限制性片段長度的變化往往同某種疾病的連鎖關係，因而可作為這種疾病的診斷指標。
如果所分析的DNA分子不太大，比如人體線粒體DNA，長16569bp。在這種DNA分子上每種限制酶的識別點不過幾個到幾十個，因此，當某種限制酶的識別點發生改變並經過這種酶切後，可清楚地看到DNA電泳帶的圖型發生改變，條帶或者增加或是減少，條帶所處的位置也有變化。可是，遺傳病病例分析時所用的是基因組DNA，而基因組DNA從限制酶酶切後至少會生成100萬個片段，多的可達1000萬個片段。如果其中有一、二個片段發生改變，不可能從電泳凝膠上直接觀察分辨。此時就必定要用合適的探針。某個目的基因或某一特定的DNA片段，在同酶切後的DNA作分子雜交後，可在曝光的X線片上看到RFLP。圖23-8是用分子雜交法檢測RELP示意圖。
圖23-8 分子印跡雜交法則 RFLPs的示意圖
這是通過限制酶A識別點的改變出現DNA的RFLP，再以合適的DNA片段作為分子雜交的探針，在探針上標記了放射性同位素，同分別經酶A，酶B完全酶切的DNA作印跡雜交。在曝光後的X線片上可看到不同的雜交帶圖型。①是正常個體，經酶A和酶B切後的DNA同探針雜交，都只看到一條帶。②是一個雜合子即隱性突變基因攜帶者的雜交圖式，由於它的一條染色體的DNA分子中酶A的識別點發生改變，酶切後的DNA片段較原來的長，所以出現一長一短兩個片段。③是突變基因純合子，也就是患者，酶A和B的酶切片段雖然是各有一個，但A的片段比正常的個體長，所以雜交帶出現的位置也有改變。從圖23-8可以看出研究RFLP的兩個重要因素，一是要製備合適的探針，二是要用儘可能多的各種限制性內切酶進行酶切和雜交。
1974年首次用RFLP作為遺傳學分析的方法。1978年簡悅威和Dozy等第一次用人體β珠蛋白基因作為探針，同限制酶Hpa Ⅰ酶切的DNA做雜交，發現了DNA的RFLP與鐮形細胞貧血之間的關係（表23-4）。
表23-4 DNA的RFLP與鐮形細胞貧血的關係
Hb基因型
Hpa Ⅰβ珠蛋白基因片段（kb）
總計 13.0kb片段的頻率
7.6/7.6
7.6/7.0
7.0/13.0
7.6/13.0
13.0/13.0 黑人AA
8
6
0
2
0
15
0.03 AS
5
1
1
9
0
16
0.31 SS
0
0
0
4
11
15
0.87 白人AA
12
0
0
0
0
12
0 亞洲人AA
15
0
0
0
0
15
0
由此可以看出，HpaⅠβ珠蛋白基因13.0kb片段可作為檢出鐮形細胞貧血及攜帶者的一種指標。1981年Geever等根據鐮形細胞貧血是β珠蛋白第6個密碼子的一個核苷酸置換的結果，用限制酶DdeⅠ酶切DNA後與β珠蛋白基因雜交。結果是：Hb基因型AA的正常個體有175bp和201bp二條帶。SS個體即患者只有一條帶，是正常人兩個DNA片段長度之和，即376bp。AS雜合子則有三條帶：175bp、201bp、376bp。其原因是第6個密碼子中的A被T置換，使Hb A變成了HbS。限制酶DdeI的識別順序為C↓TNAG，當A變成T後，該部位DNA順序變成CTNTG，從而丟失了一個DdeI識別位點，所以HbA的2個DdeI片段（175bp、201bp）變成了HbS的一個DdeI片段（175+201=376bp）。
除了用基因作探針直接檢測基因內的核苷酸變化引起的RFLP外，還有兩種途徑：一是用基因作探針，檢測該基因兩側順序中核苷酸變化引起的RFLP，確定這些RFLP與遺傳病之間有無連鎖關係。另一種是用克隆的專一DNA順序作探針，檢測基因兩側順序DNA的RFLP與遺傳病的連鎖關係。迄今用上述三種方法已查明近30種遺傳病可通過RFLP來檢測。表23-5、6、7為部位舉例。
表23-5 用基因作探針檢測基因內的結構變化來直接分析遺傳病
遺傳病 探針 年代 抗凝血酶Ⅲ缺乏症 抗凝血酶Ⅲ基因 1983 α1抗胰蛋白酶缺乏症 合成的寡核苷酸 1983 動脈粥樣硬化症 載脂蛋白A-基因 1983 糖尿病 胰島素基因 1983 Ehlers-Danlos綜合症 α（1）膠原蛋白基因 1983 生長激素缺乏症 生長激素基因 1981 乙型血友病 凝血因子ⅠⅩ基因 1983 遺傳性胎兒血紅蛋白持存症 β珠蛋白基因 1979，1983 HPRT缺乏症 HPRT基因 1983 自毀容貌症候群 HPRT基因 1983 成骨不全 原α
1（1）膠原蛋白基因 1983 視網膜母細胞瘤 Rb基因 1983 鐮形細胞貧血 合成的寡核苷酸 1983 地中海貧血 β珠蛋白基因 1981 α和β珠蛋白基因 1978，1980 甲型血友病 凝血因子Ⅷ基因 1985
表23-6 用克隆的DNA片段作探針檢測連鎖的RFIP間接分析遺傳病
遺 傳 病
探 針 探針與疾病基因座位間距離（cm）*
年 代 脆性X症候群 PN1，VK21，U6-2
＜5
1989 慢性進行性舞蹈病 G8
＜10
1983 Menkes鋼發症 L1，28
16
1983 肌營養不良 良性假肥大型 XJ和per+87系列
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1983 假肥大型 XJ和per+87系列
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1986 強直性肌營養不良 補體C3基因
7
1983 類固醇-硫酸酯酶-X鏈鎖甲癬 λRC8
25
1983 視網膜劈裂症（Retinoschisis） λRC8
15
1983
表23-7 用基因作探針檢測緊密連鎖的RFLP間接分析遺傳病
遺傳病 基因探針 年代 糖尿病（Ⅱ型） 胰島素基因 1981，1983 生長激素缺乏症（Ⅰ型） 生長激素基因 1982 高甘油三酯血症 載脂蛋白A-1基因 1983 苯酮尿症 苯丙氨酸羥化酶基因 1983
除了遺傳病與RFLP之間的關係的資料，還發現人體癌基因Ha-ras的Bam HI片段的長度可在6.75～8.7kb之間變動。這種RFLP是由於Ha –ras基因有一段可變串聯重複順序（vari-able tandem replication,VTR）。重複順序長28bp、重複次數可以不同，所以造成BamHⅠ片段的長度變化。圖23-9中左圖箭頭是某種酶的切點，黑框代表可變串聯重複順序。右圖代表某種酶切割後，不同個體顯示的電泳圖譜。1/1、2/2、3/3代表1、2、3等位基因的純合子；1/2、1/2、2/3代表三種可能的雜合子，由於重複順序數目不同改變了該酶的切點位置，因而形成不同長度的DNA片段。除Ha-ras癌基因外，成人多囊腎（adult polycystic kidney）基因旁也出現VTR，現已用它作攜帶者及產前診斷。
圖23-9 可變串聯重複順序（VTR）示意圖
三、聚合酶鏈反應
1988年Higuchi等報導，可以從人的單根毛髮的毛囊細胞中抽提DNA，並結合運用DNA聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction,PCR）技術，分析了單根毛髮細胞中抽提的線粒體DNA的D環區（D-loop region）的「DNA」指紋圖」。
PCR技術由Mullis等首創（詳見第二十二章 ）。它又稱為DNA體外擴增技術，是用DNA聚合酶在體外擴增一段DNA順序達百萬倍以上。這樣就可直接觀察而不用印跡雜交法。這項技術的基本原理是，將有待擴增的DNA分子加熱變性成為單鏈，然後加入按欲擴增DNA片段兩端核苷酸順序合成的一對引物和耐高溫的DNA聚合酶，這樣就可以單鏈DNA分子為模板合成了它的互補鏈。接著再加熱使DNA雙鏈解鏈。由於這類DNA聚合酶是耐高溫的，所以在熱變性處理後仍保持酶活性，在有引物分子存在的條件下又繼續合成該DNA片段。如此循環往復20～30多個周期，微量的DNA分子可增加10萬～100萬個拷貝。
這種技術在醫學上有很大的用途。先是Saiki等（1985）將其用於鐮形表細胞性貧血的快速診斷。繼而Chehab等將其用於Barts胎兒水腫症候群的前診斷（缺失純合型）。我國吳冠芸、曾溢滔、蔡仕萍、張基增等在不同實驗室將PCR結合寡核苷酸探針法用於已知點突變的β地中海貧血的產前診斷，並不斷簡化技術。目前PCR技術已用於許多疾病的診斷及產前診斷（如血友病、假肥大性肌營養不良、α1抗胰蛋白酶缺乏症、愛滋病等）。原則上已知DNA順序的基因及突變性質的遺傳病都可以應用此技術。此外，PCR還可用於直接做DNA順序分析。