第二節 基因治療的方法
1．基因轉移方法
（1）特異正常基因的分離與克隆：應用重組DNA和分子克隆技術結合基因定位研究成果，已有不少基因並將會有更多人類基因被分離和克隆，這是基因治療的前提，在當代分子生物技術條件下，一般來說，只要有基因探針和準確的基因定位，任何基因都可被克隆。除此，現在既可人工合成DNA探針，還可用DNA合成儀在體外人工合成基因，這些都是在基因治療前，分離克隆特異基因的有利條件。
（2）外源基因的轉移：基因轉移（gene transfer）是將外源基因導入細胞內，其轉移方法較多，常用的要有下列幾類：
1）化學法：將正常基因DNA（及其拷貝）與帶電荷物質和磷酸鈣、DEAE－葡萄糖或與若干脂類混合，形成沉澱的DNA微細顆粒，直接傾入培養基中與細胞接觸，由於鈣離子有促進DNA透過細胞有作用，某些化合物可擾亂細胞膜，故可將DNA輸入細胞內，並整合於受體細胞的基因組中，在適當的條件下，整合基因得以表達，細胞亦可傳代。這種方法簡單，但效率極低，一般1000－100000個細胞中只有一個細胞可結合導入的外源基因。要達到治療目的，就需要從病人獲得大量所需的受體細胞。當然，可以通過選擇培養的方法來提高轉化率。
2）物理法：包括電穿孔法和直接顯微注射法。
①電穿孔法：電穿孔法（electroporotion）是將細胞置於高壓脈衝電場中，通過電擊使細胞產生可逆性的穿孔，周圍基質中的DNA可滲進細胞，但有時也會使細胞受到嚴重損傷。
②顯微注射法：顯微注射（microinjection）是在顯微鏡直視下，向細胞核內直接注射外源基因，這種方法應是有效的。但一次只能注射一個細胞，工作耗力費時。此法用於生殖細胞時，有效率可達10％。直接用於體細胞卻很困難。在動物實驗中，應用這種方法將目的基因注入生殖細胞，使之表達而傳代，這樣的動物就稱為轉基因動物，目前成功使用得較多的是轉基因小鼠（transgenic mice），它可作為繁殖大量後代的疾病動物模型。
③脂質體法：脂質體（liposome）法是應用人工脂質體包裝外源基因，再與靶細胞融合，或直接注入病灶組織，使之表達。
3）同源重組法：同源重組（homologous recombination）是將外源基因定位導入受體細胞的染色體上，在該座位因有同源序列，通過單一或雙交換，新基因片段替換有缺陷的片段，達到修正缺陷基因的目的。如在新基因片段旁組裝一Neo基因，則在同源重組後，因有Neo基因，可在含有新黴素（neomycin）的培養基中生長，從而使未插入新基因片段的細胞死亡。對於體細胞基因治療，體外培養細胞的時間不能過長，篩選量大，故在臨床上應用也受限制難以進行。今後如能改進技術，提高重組率，這種定點修正基因的方法仍是有前景的。
4）病毒介導基因轉移：前述的化學和物理方法都是通過傳染方式基因轉移。病毒介導基因轉移（viral mediated gene transfer）是通過轉換方式完成基因轉移，即以病毒為載體（vector）,將外源目的基因通過基因重組技術，將其組裝於病毒上，讓這種重組病毒去感染受體宿主細胞，這種病毒稱為病毒運載體（viral vector）。目前應用的有兩種病毒介導基因轉移方法。
①反轉錄病毒載體：反轉錄病毒雖是RNA病毒，但有反轉錄酶，可使RNA轉錄為DNA，再整合到宿主細胞基因組。反轉錄病毒載體有以下的優點首先是具有穿透細胞的能力，可使近100％的受體細胞被感染，轉化細胞效率高；其次，它能感染廣譜動物物種和細胞類型而無嚴格的組織特異性；再者隨機整俁的病毒可長期存留，一般無害於細胞，但也存在缺點：這種載體只能把其DNA整合到能旺盛分裂細胞的染色體，而不適合於那些不能正常分裂的細胞，如神經元。最嚴重的問題是由於病毒自身含有病毒蛋白及癌基因，就有使宿主細胞感染病毒和致癌的危險性。因此，人們有目的地將病毒基因及其癌基因除去，僅留它們的外殼蛋白，以保留其穿透細胞的功能，試圖避免上述缺點。這種改造後的病毒稱為缺陷型病毒（defective virus）。這樣的病毒中的反轉錄酶可將RNA轉化為DNA，有助於該DNA順利進入宿主細胞的基因組，而該病毒則死亡。由於病毒整合基因組是隨機的，所以還是可能激活細胞的原癌基因，以及因隨機插入發生插入突變。
在反轉錄病毒載體中，最常用於人類的是莫洛尼（Mooney）鼠白血病病毒（murine leukemia virus;Mo-MLV），其人工構建的結構如圖14－1。
②DNA病毒介導載體（DNA viral mekiated vector）：DNA病毒包括腺病毒、SV40、牛乳頭瘤病毒、皰疹病毒等，一般認為這類病毒難於改造成缺陷型病毒，實用意義不大，但
圖14－1 Mo-MLV結構示意圖
LTR：長末端重複序列，內含啟動子、增強子及有關調節順序；gag：病毒核心抗原基因；
env：病毒外殼蛋白基因；pol：反轉錄酶基因
牛乳頭瘤病毒重組後，可不插入宿主染色體中引起插入突變，又可在宿主染色體外獨立複製，並表達出基因產物。有人發現，因缺少E1區而致複製缺陷的腺病毒，可在表達E1基因的細胞中繁殖。後來證明，載有外源DNA的複製缺陷腺病毒呈現相同繁殖的特點。1993年美法等國成功採用腺病毒載體進行心、腦、肺、肝內膽管和肌肉組織的體內基因轉移。它代表了基因治療的新方向。圖14－2是人的外源基因包裝在缺陷型反轉錄病毒中，感染細胞經培養後再輸入病人進行治療的模式圖。
圖14－2 人的外源基因包裝在缺陷型反轉錄病毒中感染細胞
經培養後再輸入病人體內進行治療模式圖
最近，美國設計了一個新的腺病症載體（圖14－3），它是用一個化學連接器即賴氨酸鏈（lysine chain）將DNA栓在病毒外殼上，這樣組成的運輸器，通過一個表面抗體而進入細胞核，使宿主基因與治療基因共同表達。這個新病毒載體稱為腺病毒多賴氨酸DNA複合體（adeno virus-polylysine DNA-complex）。
圖14－3 腺病毒賴氨酸DNA複合體
採用複製缺陷的腺病毒進行基因治療有以下優點：①該病毒可感染分裂和非分裂的細胞，並能得到大量基因產物，對神經細胞、心肌細胞等基因缺陷的糾正有特殊意義；②病毒顆粒相對穩定，並易於純化和濃縮，且感染力不降低；③可有效轉導多種靶細胞後而少游離於細胞基因組外，並持續表達；④已用於基因治療的Ad5屬腺病毒C亞群，無致癌性。前述的新腺病毒載體還有一大優點是可以成功地運載48000bp的基因，而其它病毒只能運輸70 00bp的基因。這些優點顯示了腺病毒介導載體的廣闊應用前景。
2．靶細胞：這裡所指的靶細胞是指接受轉移基因的體細胞。選擇靶細胞的原則是：①必須較堅固，足以耐受處理，並易於由人體分離又便於輸回體內；②具有增殖優勢，生命周期長，能存活幾月至幾年，最後可延續至病人的整個生命期;③易於受外源遺傳物質的轉化；④在選用反轉錄病毒載體時，目的基因表達最好具有組織特異性的細胞。目前使用得較多的是骨髓幹細胞、皮膚成纖維細胞、肝細胞、血管內皮細胞和肌細胞等。許多遺傳病與造血細胞有關，故可用於如β地貧、嚴重複合免疫缺陷病等的基因治療。皮膚成纖維細胞易於移植和從體內分離，又可在培養中生長，並易存活，故有人用之於乙型血友病的基因治療。有不少遺傳病表現了肝細胞功能缺陷，因此，在家族性高膽固醇血症的治療中，有將低密度脂蛋白（LDL）受體基因轉移至肝細胞的嘗試。在動物實驗中已證明：β－半乳糖苷酶基因、ADA基因、小肌營養不良蛋白（minidystrophin）基因都已證明能在肌細胞中表達。