前言
Preface
文 l 郭佳腺相關病毒（AAV）載體介導的基因治療藥物被批准用於遺傳性失明和脊髓性肌萎縮的治療，對其他罕見疾病，包括血友病和杜氏肌營養不良，也取得了很好的治療效果。對AAV進行載體工程修飾可以提高AAV的轉導效能（基因表達盒工程）、載體向性（衣殼工程）和避免宿主免疫應答，除此之外優化AAV的大規模生產，這些都是基因治療藥物能否成功的關鍵因素。
第 53 期
作者 l 郭佳
來源 l 維渡縱橫（WeDimension）
基因治療最簡單的形式是通過非病毒或病毒載體將遺傳物質引入靶細胞，通過糾正或補充缺陷基因來治療或預防疾病。基因治療的效果可能是持久的，不需要反覆幹預，可以通過體外和/或體內策略實現。體外基因治療使用從病人身上獲取的靶細胞，經過基因改造後再注入病人體內。體內基因治療將遺傳物質直接導入目標器官或患者組織中。
各種類型的基因傳遞策略已經被用於治療各種各樣的疾病。大多數由特定基因缺陷引起的疾病(如由於編碼凝血因子的基因突變引起的血友病)可以通過傳遞缺失的基因來糾正。由錯誤摺疊蛋白質的毒性引起的疾病(如亨廷頓病)，可以通過傳遞核酸(例如siRNAs)來抑制過表達的基因(即RNA幹擾)來治療。對於某些由未知基因突變引起的疾病，基因治療可用於提供改善疾病表型的產品（例如用於溼性年齡相關性黃斑變性的抗血管內皮生長因子、感染性疾病的抗體和用於充血性心力衰竭的鈣信號蛋白）。
近幾十年來，病毒載體介導的基因療法已被用於臨床試驗，以治療心血管、肌肉、代謝、神經系統、血液學、眼科疾病以及感染性疾病和癌症。AAV載體是業內關注的重點，它具有有益於臨床應用的獨特特性，包括趨向性廣、免疫原性低、易於生產；它也是非致病性的，很少整合到宿主染色體中，導致轉基因的長期表達。然而，儘管AAV載體在臨床中取得了可喜的治療效果，但人們越來越關注其轉導效率和人體對AAV轉導細胞產生的免疫反應。
在本文中，我們將討論如何通過「載體工程」來增強AAV載體的轉導效率（基因表達盒工程）、載體向性（衣殼工程）、克服患者的免疫障礙，以及提升AAV的產量，此外介紹預測AAV基因治療藥物臨床試驗中轉導率的方法。
一
AAV載體和基因治療
AAV是一種單鏈DNA細小病毒，其基因組包括rep基因和cap基因，兩側有兩個末端反向重複序列(ITRs)。rep基因由單個ORF、Rep78、Rep68、Rep52和Rep40編碼，幫助AAV基因組複製和病毒粒子組裝。三種衣殼蛋白(病毒蛋白VP1、VP2和VP3)由單個cap ORF生成，但由一個罕見的起始密碼子(ACG)轉錄調控和可變剪接，因此，VP1和VP2的C末端與VP3具有相同的胺基酸。此外，裝配激活蛋白(AAP)對衣殼裝配至關重要，它由cap基因內的一個框內摺疊ORF編碼。所有AAV病毒粒子均由60個VP亞基組成，VP1:VP2:VP3的比例為1:1:10。每個亞基在病毒粒子表面有9個可變區域，它們決定AAV載體的主要取向和細胞內運輸，通常是中和抗體(NAbs)識別的區域。基因修飾這些可變區域可以改變AAV的轉導效率和NAbs與病毒粒子表面的結合能力。
AAV的結構和基因組
研究表明AAV通過在細胞表面結合主受體和共受體感染靶細胞，從而觸發其內吞進入內小體。在結構改變暴露了VP1和VP2的N末端後，AAV病毒粒子從核內體中釋放並在細胞核周圍區域積累。AAV病毒粒子一旦進入細胞核，就會脫殼並釋放其單鏈基因組，並將其轉化為雙鏈DNA (dsDNA)模板，在雙鏈DNA模板上進行轉基因的轉錄和翻譯。
AAV載體轉導途徑
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重要的是，只有145 bp的ITRs對於rAAV的增殖是必要的，ITR能夠誘導轉基因表達，在載體生產和確保在細胞中持久轉導發揮重要作用。因此，基本上96%的AAV基因組可以被移除，以允許對AAV載體改造而進行基因治療。
到目前為止，已經分離和研究了至少12個自然血清型和100多個變異的AAV作為基因傳遞載體，並從這些載體中不斷生成AAV突變體，以優化AAV用於基因傳遞的使用。不同的AAV血清型具有不同的結合受體和組織趨向。
在rAAV轉導過程中，衣殼的特異性細胞毒性T淋巴細胞(CTL)應答會清除rAAV轉染的靶細胞，從而降低轉基因表達導致治療失敗，而CTL反應的水平依賴於靶細胞上呈現的衣殼特異性抗原的水平，這和器官移植手術中的急性免疫排斥很類似。比如在所有血友病研究中，rAAV介導的FIX基因在患者中的表達低於臨床前動物模型：給予每公斤體重1×10E11劑量的rAAV8–FIX使F9敲除小鼠血液中的FIX水平提高到野生型小鼠FIX水平的160%；然而對靈長類和人類給予每公斤體重2×10E11個rAAV8–FIX，相對於健康個體，血液FIX水平僅增加40%或<1%。
在rAAV轉導成功後，基因表達盒會產生先天免疫反應，會產生類似移植手術中的慢性免疫排斥反應，導致基因治療藥物在體內發生長期毒性、表達量無法控制，並很快在體內沉默。
通過基因修飾rAAV載體即載體工程，優化AAV的基因表達盒和衣殼，可以提高AAV的轉導率、安全性和體內存活時間。下文將著重分析其成藥的關鍵因素。
二
載體工程是成藥關鍵
載體工程包括「基因表達盒工程」和「衣殼工程」，直接影響基因治療藥物的有效性、安全性和持久性。
01
基因表達盒工程
rAAV基因表達盒的設計可以在兩方面增加基因治療藥物的成藥性，一方面是提高目標基因的轉到效率和表達量；另一方面是降低免疫排斥反應並防止轉基因沉默。
AAV基因表達盒可以被設計以增強AAV的轉導，並使AAV能夠逃避免疫應答。通過突變AAV載體上的ITR，可以防止Rep蛋白的剪切，產生自互補的AAV載體，增強載體轉導，ITRs的突變也可能降低AAV的先天免疫反應；使用小型組織特異性啟動子可以增加組織特異性轉基因表達和AAV基因組的包裝能力，並最小化對AAV的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)免疫反應；轉基因密碼子的優化增加了轉基因AAV的轉錄和翻譯，降低了對AAV的免疫應答；使用合成的poly(A)可以增加mRNA的核出口、翻譯和穩定性（通過增強聚腺苷酸化），另外使用反向的poly(A)可避免ITR的轉錄，兩種方法都增強了AAV轉導，而反向poly(A)降低了對AAV的先天免疫反應；最後，使用雙AAV載體或交叉包裝AAV基因組可以使大體積轉基因有效且有功能的表達。下文將詳述基因表達盒中每個組成部分的影響。
>>> ITRs的工程化
AAV轉導率的限制是由於在mRNA轉錄開始之前，需要從單鏈AAV基因組合成dsDNA，這一必經的分子步驟是由ITRs啟動的。通過突變一個野生型ITRs，可以克服rAAV感染後合成第二鏈的需要。因此，突變的ITR不適合作為Rep68和Rep78蛋白的底物，從而阻止了複製的末端分解，導致特異性的自互補AAV (scAAV)中間體的產生。scAAV中間體包含了正鏈和負鏈的DNA，當被包裹在病毒粒子衣殼中時，與野生型AAV不同，只包裝了一個單鏈的正鏈或負鏈的DNA基因組，當scAAV中的基因表達盒被改變的ITR融合，兩個互補的部分被送到細胞核時，立即退火形成dsDNA，立即發生轉錄。值得注意的是，由scAAV編碼的GFP或FIX比傳統單鏈AAV載體編碼的GFP或FIX表達更快，表達水平更高。2019年，FDA批准了治療脊髓性肌萎縮（SMA）的基因治療藥物Zolgensma，而scAAV載體正是其重要組成部分，該基因治療藥物由AveXis公司研發，2018年被諾華製藥以87億美元併購。
儘管ITR的合理設計增加了AAV轉導效率，但scAAV載體的使用依舊是有限制的，他們只能容納不高於2.5kb的基因表達盒，提高AAV包裝能力可以進一步提高scAAV技術的應用。
>>> 啟動子(Promoter)的工程化
首先，由於AAV的包裝容量有限，必須對包括啟動子在內的所有順式元件進行優化；同時，結合不同特異性啟動子和增強子元件，生成小型啟動子和增強子，用於rAAV的有效包裝和轉導。例如，Chuah等全基因組篩選鑑定出14個肝細胞組織特異性順式作用調節模塊，長度從41-551 bp不等，包含進化保守的轉錄因子結合位點基序簇；含有順式作用的調控模塊元件和肝臟組織特異性啟動子的rAAV基因表達盒在小鼠中的表達量是僅含啟動子的rAAV的10 ~100倍。事實上，生物技術公司已經把重點放在優化基因治療的啟動子上，下一代rAAV載體可能來自模塊化的組件，這些組件都已針對AAV表達進行了優化，並在臨床研究中進行了測試。
近年來，越來越多的製藥公司發現啟動子不單單和基因表達量有關，更重要的是會影響基因治療作為藥物的安全性(免疫反應)和表達時限。啟動子本身並無編譯功能，但它擁有對基因翻譯胺基酸的指揮作用，就像一面旗幟，其核心部分是非編碼區上遊的RNA聚合酶結合位點，指揮聚合酶的合成，這種酶指導RNA的複製合成，一旦該段位的啟動子發生突變/變異，將對基因的表達有著毀滅性作用。
rAAV傳遞的轉基因可引發適應性免疫反應，包括CTL反應和抗治療蛋白異源抗體的形成，使用組織特異性啟動子可以防止先天免疫反應和防止其在抗原呈遞細胞中的表達並減少轉基因誘導的CTL(細胞毒性T淋巴細胞)反應。研究顯示，在rAAV轉導成功後依舊會產生免疫應答，特別是直接選用外源性的通用型啟動子如CMV、CAG等而沒有任何結構的改良，會產生類似移植手術中的慢性免疫排斥反應，導致基因治療藥物在體內發生炎性反應、表達量無法控制（快速升高後急劇下降），並很快在體內沉默，這些現象雖然還沒有足夠多的文章發表，但是已經引起基因治療領域的高度重視。
過往在rAAV載體中使用的啟動子大多為單向通用型啟動子，如CMV、CBA、CAG、PGK、EF-1α，來實現在細胞中的高表達；雖然設計並篩選出組織特異性啟動子要比通用型啟動子複雜很多，但組織特異性啟動子可開啟一個更具細胞特異性和自然的表達譜，增加目標基因表達效能，並且不易沉默。例如兩個rAAV-RPE65基因療法使用了兩個組織特異性啟動子，一個1.6 kb長的RPE65啟動子和一個縮短為750 bp (NA65p)的啟動子，其中rAAV-NA65p-RPE65基因表達載體也有其他修飾（SV40內含子、Kozak序列、密碼子優化）以提高hRPE65表達的效力和細胞特異性，發現在視網膜中，改造過的NA65p啟動子比長啟動子RPE65更少被沉默；研究顯示，CMV啟動子在視網膜、海馬體、脊髓或黑質中起初會促進急劇表達，十周後開始出現沉默現象（在紋狀體中CMV未發現快速沉默現象），而改用光感受器組織特異性啟動子則在上述組織中都可持續表達；另外，由於rAAV的包裝容量有限，像CBA/CAG (1661 bp)這樣的長序列啟動子在最近的臨床試驗產品中已經並不常見。
組織特異性啟動子的缺陷是體積較大、目標基因表達量比CMV低，但是經過設計優化和篩選，已經有不同的組織特異性啟動子應用於眼科，表達量和CMV等通用型啟動子數量級相當，並且不易在體內沉默。
視網膜組織特異性啟動子
高光坪教授在其2019年發表的綜述中提到，特異性表達是基因治療的一個重要方面，在脫靶組織或細胞類型中的基因表達可能導致毒性或觸發不必要的免疫反應。從rAAV基因組設計的角度來看，最好的策略就是讓基因在特定部位持續表達，需要通過使用組織特異性啟動子和/或融合miRNA的3-UTR結合位點，這涉及到承載高水平miR-142-3p的抗原呈遞細胞，在基因表達盒中包含miR-142-3p結合位點，可以有效降低抗原呈遞細胞中轉基因的表達，並極大地降低對轉基因產物的免疫排斥反應。
Jan Wijnholds教授在其2020年發表的綜述中總結到，在2013年之前，全球使用的均為通用型啟動子CAG或者CMV或者改造的CAG，在2013年以後，越來越多的基因治療選擇組織特異性啟動子。
AAV血清型和啟動子的應用發展
筆者也統計了十三年來眼科基因治療應用的啟動子、內含子、PolyA的選擇情況和臨床實驗進展。
眼科基因治療藥物應用
2019年8月13日，AAV基因療法的Asklepios BioPharmaceutical (AskBio) 宣布收購Synpromics，Synpromics致力於基因控制合成啟動子技術、生物信息學和智能數據驅動設計領域，以實現更精確的細胞靶向和基因表達，該公司的啟動子（Promoter）技術和製造系統授權給其它基因治療公司以獲得商業權益。AskBio成立於2001年，由Jude Samulski博士、華裔科學家肖嘯博士和Sheila Mikhail博士聯合創立。
Synpromics啟動子技術
截至目前，通過公開數據得知，目前國內至少有3家應用組織特異性啟動子的基因治療公司，分別為信念醫藥、諾潔貝、傲業生物。
另外，基因治療一直被認為存在固有的風險，因為一旦它們被傳遞到患者的細胞中，就永久性的改變了患者的遺傳物質且無法被關閉或調整。因此，誘導型基因治療也開始在臨床上應用，基本思路是開發具有基因開關作用的誘導型啟動子。美國斯克裡普斯（Scripps）研究所的Michael Farzan博士和其團隊發現了一種可逆性的RNA開關，可通過注射反義嗎啉環寡核苷酸( morpholino)在體內調控AAV轉基因的表達。這一研究成果於2019年12月23日發表在《Nature Biotechnology》上，為基因治療開發者提供了可行的技術來調整治療性基因的活性水平。這一技術似乎解決了一個主要的安全問題，從而可能使這種基因治療策略得以更多地使用。國內葉海峰團隊也開發了一種阿魏酸調節的基因開關。在應用方面，國外的Intrexon和Ziopharm已經將誘導型基因治療推進到了II期臨床研究。
>>> 轉基因(Transgene)的工程化
臨床試驗中使用的大多數治療性轉基因來自於自然基因序列，自然基因序列的密碼子沒有優化。對於優化密碼子，宿主物種的整個基因組cDNA被用來驅動有機體的密碼子使用偏性(這通常反映了個體tRNA的濃度)。後來的研究發現，tRNA濃度在組織和細胞類型之間存在差異，為優化特定組織的基因治療藥物結構，一項研究檢查了組織特異性和細胞類型特異性密碼子使用偏好表，用於密碼子在肝臟中的優化，結果顯示在人肝細胞系和小鼠肝臟中，編碼FVIII的rAAV載體的密碼子優化序列比含有野生型FVIII序列的rAAV載體誘導的FVIII表達水平更高。當rAAV載體被開發用於臨床研究時，密碼子的使用多是標準優化。大多數供應商都會優化密碼子，然而值得注意的是，同一個基因經過不同供應商優化後，表達量會比野生型序列增加2-9倍不等，這些觀察結果表明，我們對優化轉基因密碼子的理解還遠遠不夠，進行測試時應該謹慎看待。
>>> AAV載體的包裝
許多轉基因，比如編碼肌營養不良蛋白的基因(治療杜氏肌萎縮症所需的基因)，FVIII(用於治療血友病A)和視網膜特異性磷脂轉運ATP酶ABCA4(用於治療視網膜變性疾病如黃斑變性疾病)等，由於體積太大而不能有效地包裝成AAV病毒粒子。一些大體積轉基因在剪切後已被用於臨床試驗並獲得了成功，近年科學家們也開發了其他一些策略，可以使用AAV載體在動物體內傳遞更大體積的轉基因。
第一種方法是利用AAV傳遞後，通過ITR序列的同源重組將AAV基因組合併。大體積的基因表達盒可以分到兩個或更多的載體，並運送到相同的細胞，病毒在細胞核中脫殼後，片段之間同源重組形成完整的轉基因組。這種方法已經在動物身上成功地傳遞了2-3個獨立的AAV載體，並成功表達了功能性肌萎縮蛋白。
第二種方法是，被截斷的基因片段在載體基因組上不限定的位置被包裝成不同的AAV病毒粒子，AAV病毒粒子的混合群體中含有不同長度的截斷基因片段，這些轉導後的雙重AAV載體，通過將兩個不同的AAV載體基因組重疊區域進行同源重組，或者通過單鏈模板將不同的AAV載體基因組在互補區域進行退火，從而產生完整的基因表達盒。特異性的重疊片段也可以添加到每個AAV載體的末端，促進同源重組。
第三種方法是為了克服前兩種方法的局限性，上述方法缺陷在於共聚合可以得到無功能的重組產品，使用截斷的重疊基因片段會在轉基因的中間部分產生一個不需要的ITR結構。雜交雙載體策略結合了重疊區域和內含子剪接位點，這種方法依賴於AAV基因組的共聚合活性，通過重組將獨立的AAV載體基因組聚合到一起，以確保轉導後產生正確的轉基因蛋白，這一策略可能會增加全功能蛋白的表達。
第四種方法是將AAV基因組交叉包裝到其他細小病毒的衣殼中。
02
衣殼工程
除了自然發現的AAV，設計AAV衣殼的主要技術有三種：合理設計、定向進化和計算輔助設計。
>>> 定向進化
定向進化是模擬自然進化的機制，在衣殼蛋白中引入大量隨機突變，然後在選擇壓力下篩選出具有特定生物性質和特徵的衣殼。另外，在離散區域或整個cap基因上的易錯聚合酶鏈反應（error-prone PCR）也是篩查生成衣殼庫的一種可行方法。
>>> 自然發現
AAV最初被發現為細胞培養汙染物，這就是最廣泛使用的血清型AAV 2；目前最具有臨床應用潛力的AAV血清型都是從天然來源中分離出來的，其中的典型範例就是AAV9，它是從人類肝組織中分離出來的。目前已經分離和研究了至少12個自然血清型，如下表所示。
AAV血清型的性質和臨床應用
流行病學分析表明，40%-80%的人血清抗AAV抗體呈陽性反應，這表明人源性衣殼可能並不是最理想的基因治療載體，因為已經存在的AAV衣殼免疫可能會降低傳導效率。解決這一難題的策略包括使用從非人靈長類中分離的AAV衣殼，以及其它脊椎動物中分離的AAV衣殼蛋白。目前，從非人靈長類動物和豬身上獲取的AAV衣殼種類在實驗中表現出良好的轉基因遞送能力。
>>> 合理設計
合理設計是改良病毒載體衣殼的首選策略之一，第一種方法是將特定多肽序列嫁接在衣殼表面，讓它們可以與特定細胞表面的受體相結合。
另一種方法是擾亂細胞對衣殼蛋白的降解過程。定點突變表面暴露的酪氨酸殘基，通過抑制蛋白酶體降解和促進細胞內轉運，促進靶細胞轉導。
>>> 生物信息學和計算機輔助設計
生物信息學和計算機工具可以通過比較不同AAV的衣殼蛋白序列，推斷出衣殼蛋白的進化過程，並且發現衣殼蛋白上具備高度多樣性的區域。結合高通量測序，可以使用生物信息工具來設計衣殼變異庫，以確定允許操作的高變異性區域。
美國生物技術公司 Dyno Therapeutics 推出其專有平臺「CapsidMap」，該平臺把 AI 運用在當前的基因治療技術中，可以設計新穎的腺相關病毒（AAV）載體，公司宣布與諾華和 Sarepta Therapeutics 達成了合作關係，共同開發針對眼部疾病、神經肌肉和心血管疾病的基因療法。
三
躲避免疫障礙
雖然AAV載體已成功應用於臨床研究，但宿主免疫反應是其誘導有效且長期治療性基因表達的主要障礙。臨床試驗數據提示AAV載體在低劑量給藥時，免疫反應不強烈，但在高劑量給藥時可能引起較為強烈的炎症免疫反應，對組織器官表現出毒性效應（也有報導稱發現獨立於炎症之外的毒性），此外免疫反應還會抑制其藥效。
免疫反應主要包括適應性免疫反應(adaptive immunity)如CTL應答、NAbs和對AAV轉導後的先天免疫反應（innate immunity）。
中和抗體(NAbs)結合到腺相關病毒(AAV)載體病毒粒子的表面，以防止AAV病毒粒子與靶細胞相互作用並進入靶細胞，並阻止AAV病毒粒子在細胞核內的有效的細胞內運輸和脫殼（1）；AAV病毒粒子通過內吞作用進入細胞後，在核內體中降解，使AAV基因組或衣殼暴露於toll樣受體9 (TLR9)或TLR2等受體，通過MYD88驅動途徑觸發先天性免疫應答，需要注意的是，不同類型的細胞可能包含不同的先天免疫傳感器（2）；一些AAV病毒粒子能成功逃脫核內體進入細胞質，它們的衣殼在蛋白酶體中被泛素化並降解為小肽和表位（3）；這些小肽和表位被裝載在MHC I類分子上，呈現在靶細胞表面，使細胞被識別，並最終被特異性細胞毒性T淋巴細胞(CTL)反應所消除（4）；AAV病毒粒子到達細胞核並脫殼（5）；轉錄發生，正鏈和負鏈RNA由AAV基因表達盒的ITRs生成，並輸出到細胞質中形成雙鏈RNA（6）；雙鏈RNA被dsRNA傳感器MDA5/RIG-I識別（7），激活了先天免疫反應（8）；轉基因表達後，任何錯誤摺疊的蛋白在蛋白酶體中被降解（9），產生的小肽和表位再次結合MHC I類並觸發CTL對轉基因組的反應，以至於AAV轉導的靶細胞可被轉基因特異性CTL識別和清除（4）；最後，治療產物可被分泌到循環中，並被抗原呈遞細胞吸收以激活B細胞，產生抑制劑，通過體液免疫反應中和治療蛋白（10）。
影響rAAV基因治療的免疫學障礙
01
躲避先天免疫反應
先天免疫反應的強弱是影響整個免疫反應的關鍵因素，抑制AAV基因治療的先天免疫反應策略，有助於降低炎症副反應，對提高AAV基因治療的安全性及長期有效性具有重要意義。
研究顯示，衣殼和基因表達盒均能引起先天免疫反應，AAV衣殼可能在核內體中被降解，釋放AAV基因表達盒，使其能夠被TLR9識別。AAV基因組及其衣殼誘導的先天免疫反應主要是由於TLR2和TLR9的模式識別，scAAV載體比傳統單鏈AAV載體引發更強的反應；近期研究結果顯示，基因組的dsRNA也許作為病原體相關模式參與了針對AAV載體的先天免疫，這也是為什麼臨床實驗給藥AAV載體數周后才出現的免疫反應，具體原因是AAV載體的ITR也可作為啟動子啟動基因表達盒dsRNA的表達，dsRNA可以被MDA5/RIG-I識別，從而激活轉錄因子NF-κB和IFN的表達，觸發先天免疫反應，所以基因表達盒中的各個元件需要特殊設計才能有效規避先天免疫反應。
對於有效規避先天免疫反應的手段，目前主要在於阻斷或幹擾TLR的模式識別、設計基因表達盒的ITR和組織特異性啟動子。
在TLR9缺乏的小鼠中已經觀察到高水平的轉基因表達，這促使幾個研究機構修整或突變基因表達盒以減少或幹擾其TLR9模式識別，例如，通過設計AAV基因表達盒來降低TLR9對其CpG位點的識別，肌肉注射CpG缺失的AAVrh32.33載體後，在效應T細胞浸潤較少的情況下實現持久性轉基因表達，這種策略已經在血友病患者的臨床試驗中使用，儘管沒有足夠的數據來判斷它的獲益。另一種幹擾先天性免疫應答的策略是基於某些寡核苷酸可以幹擾TLR9-靶點結合的識別，整合寡核苷酸，如來自端粒的(TTAGGG)4序列，進入AAV基因表達盒中，降低了小鼠TLR9介導的先天免疫應答，增加了AAV轉導效能。這兩種工程方法都需要對AAV載體盒做最小的改變，以增強載體在動物中的轉導，目前尚不清楚哪種更優或者合併這些方法是否會產生協同效應。
值得注意的是，近來研究發現，在使用AAV基因治療後6-10周，部分患者的轉基因編碼蛋白水平下降，這可能和衣殼特異性的CTL可以消除AAV轉導的靶細胞和在AAV轉導完成後基因表達盒的先天免疫反應有關，基因表達盒轉錄形成的dsRNA介導的先天性免疫應答可能是導致晚期治療失敗的原因之一。研究顯示，在AAV長期轉導後，靈長類視網膜組織中幾個參與先天免疫應答的基因（包括MDA5）均被上調，減弱或消除ITRs的啟動子功能，或設計特殊基因表達盒來阻斷ITR的轉錄，可以減少dsRNA的形成，並可能消除這一擔憂；或者針對dsRNA傳感器或其下遊信號通路的短髮夾RNA克隆到AAV盒中，以阻斷dsRNA介導的先天免疫應答的激活；或者選擇合適的組織特異性啟動子降低先天免疫反應，有助於降低炎症副反應，已有研究顯示組織特異性啟動子可以避免AAV對視網膜的組織破壞和炎症反應的發生，但具體的機制還在研究和探討之中。
02
躲避適應性免疫反應
>>>
基因表達盒的影響
AAV傳遞的轉基因可引發適應性免疫應答，包括CTL應答和抗治療蛋白異源抗體的形成，使用組織特異性啟動子可以限制AAV病毒粒子轉導到靶細胞(例如在肌肉或肝臟中)，阻止其在抗原提呈細胞中的表達，降低轉基因誘導的CTL反應。
由於主要組織相容性複合體(MHC) I類通路主要以抗原的形式呈遞轉基因產物，阻斷該通路可能會阻止CTL對轉基因的反應，事實上，從病毒中提取的小肽，如從巨細胞病毒中提取的獨特的短US6糖蛋白和從單純皰疹病毒中提取的感染細胞蛋白47 (ICP47)，可以通過多種機制抑制MHC I類通路，將編碼這些病毒肽的基因融合到AAV轉基因細胞中，以避免CTL介導的消除。
另外，引入內源性miRNA介導的調控機制，在抗原呈遞細胞中下調轉基因表達，降低基因表達CTL反應。
>>> 衣殼的影響
躲避中和抗體
根據已發表的研究，>90%的人感染了AAV，約50%的人可能有中和抗體（NAbs）。對於需要全身使用AAV載體才能成功治療的患者，例如患有神經系統疾病和肌肉紊亂的患者，NAbs尤其成問題。
非遺傳學的方法來降低NAb水平包括使用藥物，如利妥昔單抗和雷帕黴素，阻止B細胞產生NAbs；或通過單採血漿技術(Plasmapheresis)，減少NAbs血滴度；或使用脂質體或細胞來源的胞外囊泡覆蓋AAV抗原表位，防止他們被NAb識別；然而，這些策略要麼效率低，要麼改變AAV生物學特性，要麼增加AAV衣殼抗原載量。
對AAV衣殼直接進行基因改造以避開NAbs可能是最優的選擇，科學家們正嘗試使用合理設計和定向進化的AAV衣殼來做到這一點。
對AAV病毒粒子如何與特異性單克隆抗體相互作用的進一步了解，使我們能夠合理設計出更多能夠逃脫NAb活性的AAV突變體，不影響載體的產生、轉導效率或組織趨向性。AAV顆粒上的NAb識別位點可能在進化上是保守的，並位於一個特定的區域，該區域殘基的合理突變可以使突變病毒規避NAbs的識別。例如AAV2單克隆抗體A20識別AAV2衣殼的多個殘基，包括VP1的265殘基區域，並阻斷AAV2轉導，通過合理的設計，AAV2衣殼被設計成AAV2.5，它在VP1的265殘基處發生突變，使A20無法識別或阻止A20對細胞的轉導。
定向進化也被用於分離AAV突變體。例如在採用易錯聚合酶鏈反應（error-prone PCR）方法，產生AAV2衣殼隨機突變文庫，在AAV抗體陽性的人血清中篩選後，分離出對HEK293細胞具有高趨向性和能夠逃避NAbs的突變體。
規避CTL反應
通過合理設計，AAV衣殼也可以被設計用於避免衣殼特異性CTL反應。AAV轉導導致衣殼抗原在靶細胞表面交叉呈遞，這種交叉呈遞由MHC I類抗原呈遞途徑介導，由泛素介導AAV衣殼降解。AAV衣殼中賴氨酸殘基的泛素化能被蛋白質磷酸化促進，賴氨酸殘基或酪氨酸或絲氨酸磷酸化位點的突變會增強AAV在細胞中的轉導。此外，AAV衣殼的磷酸化位點突變，以避免泛素化和蛋白酶體介導的衣殼降解，逃脫了衣殼特異性CTL介導的對轉導的靶細胞清除。
四
rAAV的生產與純化
工業界正在努力幫助科學家將基因療法快速推向市場，已經開發出一些產品來支持質粒和病毒載體的生產。
AAV生產工藝流程
01
AAV載體的生產
製造足夠的AAV載體用於臨床試驗是一個挑戰，特別是對於治療神經或肌肉疾病的基因治療，通常每公斤體重使用>1×10E14的劑量。目前AAV載體製備常用的方法為三質粒共轉染HEK293細胞；另外一種是使用昆蟲細胞-杆狀病毒表達載體系統（BEVS）。
AAV載體通常在HEK293細胞中產生，通常利用三個獨立的質粒：一個順式載體質粒編碼AAV反向末端重複序列和目的基因，一個反式質粒編碼AAV的rep和cap基因，一個輔助質粒通常編碼腺病毒的輔助基因。質粒通常在重組的大腸桿菌（E.coli）中發酵生產，載體和宿主菌株的篩選結合生長條件的優化（培養基和發酵條件）可有效地提高質粒產量。當使用搖瓶和WAVE生物反應器時，HEK293細胞無血清懸浮培養比貼壁的HEK293細胞產量更高，採用無血清培養基，因為其降低了添加血清的潛在汙染風險，使用更符合cGMP的要求，常用於臨床應用AAV載體的製造，已獲批上市的治療先天性黑朦病藥物Luxturna即由Spark Therapeutics使用該方法生產。研究人員也在發展其他穩定生產的細胞系，但目前仍處於研究階段。
用BEVs載體感染Sf9昆蟲細胞進行rAAV生產是用杆狀病毒Baculovirus攜帶Rep/Cap基因及ITR基因組，去感染懸浮培養的SF9昆蟲細胞，包裝出rAAV。該系統可通過穿梭載體靈活裝載外源基因的片段，並在細菌內高效重組到杆狀病毒基因組上，再將抽提出的重組杆狀病毒基因組DNA經轉染Sf9昆蟲細胞，產生有感染活性的重組杆狀病毒。然後，利用重組杆狀病毒（BEV）感染懸浮培養的Sf9細胞生產rAAV，上市藥物Glybera就是用的這種方法。
此外還有穩定細胞株生產方法，建立起含有rAAV的Rep/Cap基因或ITR基因組的穩定細胞株（常用Hela細胞），再用輔助病毒來感染生產出rAAV。此方法的缺點是穩定細胞株的建立與鑑定需要很長時間，需要注意細胞株多次傳代後的穩定性。
AAV生產面臨的主要挑戰源自AAV載體本身，例如空衣殼或包裝不完全的衣殼。空衣殼不包含DNA，輸注給患者時可引起免疫毒性。包裝不完全的衣殼可與完整衣殼競爭以感染患者的細胞，給藥劑量中非活性病毒的衣殼的量越大，患者為達到治療效果所需的藥物總劑量就越高，給藥劑量越高，發生嚴重副反應的風險越高。
02
AAV載體的純化
目前提純AAV的技術有兩種：密度梯度離心和親和層析純化，組合這些方法可以確保更高純度的AAV產品。幾種AAV配體已被用於親和層析、包括肝素、粘蛋白、A20單克隆抗體、AVB瓊脂糖親和樹脂；利用AAV衣殼表面的表位進行純化也進行了探索；例如，AAV載體可以被生物素化或改造編碼hexa組氨酸標籤（His6標籤），分別用抗生物素蛋白或Ni-NTA柱進行純化；某些AAV血清型對於AVB瓊脂糖親和樹脂的親和力能夠通過合併具有最高親和力的AAV血清型的關鍵殘基而被增強，同時不影響載體的轉導效率。由於AAV工程一般不會明顯改變其分子量和結構，對AAV衣殼進行基因修飾雖然會影響親和層析，但不太可能影響密度梯度離心。
值得注意的是，由於空衣殼或包裝不完全的衣殼和含載體的衣殼具有相同的胺基酸組成，親和層析不能區別它們（離子交換層析除外）。AAV空衣殼被用作誘餌來阻止NAbs識別含有載體的衣殼，儘管它們增加了AAV衣殼的抗原載量，可能引起不必要的免疫反應。近年來，開發了一種新型的親和層析和離子交換層析雙柱純化平臺，該平臺可與多種AAV血清型兼容，該方法製備的AAV載體純度高，空衣殼汙染少。
五
評價基因治療的有效性
雖然在AAV載體工程方面取得了進展，但是在一些動物模型中顯示陽性結果的rAAV可能在其他物種中無效,而由於直接在人體內實驗又是是不切實際和不道德的，因此需要開發能夠評估AAV轉導和預測載體在人體試驗中的有效性的系統。
01
動物模型
雖然多種動物模型已被用於評估治療效果、毒性和對AAV基因治療的免疫反應，但小鼠模型的結果不能對大型動物、人類甚至其他小鼠品系進行100%的推斷。例如，用於治療小鼠血友病的類似劑量的AAV載體，在大型動物和人類中分別降低了10倍和100倍的治療效果；此外，從C57BL小鼠的大腦中分離的AAV PHP.B對這些小鼠腦的轉導效率比AAV9更高，但並沒有改善對其他小鼠品系或動物物種大腦的轉導。為了克服這些問題，科學家建立了人源化的小鼠模型來測試rAAV血清型和rAAV在含有人類組織的小鼠中的轉導效率。
02
類器官或3D組織培養
類器官或3D組織培養系統可用於評估AAV的轉導效率。類器官是由特定細胞分化而成的體外三維微型器官，用於研究疾病的發病機理和治療方法；由於類器官由人體細胞產生，它們可能比動物模型更能反映人體的生理狀況，但到目前為止，所有的類器官模型都表現出胎兒樣組織表型，這可能限制了它們在評估AAV轉導效率方面的應用。
六
結論與展望
AAV基因療法在臨床應用中依舊面臨著挑戰，包括人類的轉導效率低於在動物模型中的轉導率、AAV衣殼或轉基因組的免疫反應、低效的AAV病毒生產和純化方法、缺乏可靠的系統來評估預測人體臨床試驗的AAV轉導效率以及高昂的生產純化成本。AAV的載體工程有可能克服這些障礙，我們也確實看到AAV衣殼工程可以增加AAV的轉染性，使AAV能夠逃脫NAbs；基因表達盒工程可以增加轉基因的表達並防止先天免疫反應和適應性免疫反應。越來越多的動物模型和類器官模型被開發和應用，將會為基因治療從動物到人體的轉導率預測提供更多的有力手段。
將AAV轉化為基因治療載體的過程需要分子生物學、生物信息學、傳染病學、結構生物學、免疫學和基因組學等多學科的聯合研究。隨著國內科技水平的不斷提高和政策的大力支持，近兩年來越來越多的海內外基因治療科學家成立創業公司，出現了諸如信念醫藥、賦源生物、嘉因生物、諾潔貝、至善唯新、傲業生物、紐福斯、輝大基因、克睿基因、中因科技、安龍生物、和元生物、五加和、派真生物、源興基因等公司，掀起國內基因治療的浪潮。
引用資料
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作者簡介
郭佳，瀋陽藥科大學製藥工程博士，美國 Bruch S. Blumberg Institute博士後研究員。聚焦生物醫藥、醫療器械等醫療硬核股權投資。曾任職於久友資本、中鈺資本、遠大集團諾康生物，提倡通過資本、管理和資源的輸出，運用「產學研融」四位一體化理念，促進新經濟企業健康發展。
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