首次通過Cas9對Rpe65基因的治療性修正,為治療先天性失明提供新方法

2021-01-13 健康界

先天性黑蒙症(Leber’s congenital amaurosis,LCA)，是發生最早、最嚴重的遺傳性視網膜病變, 出生時或出生後一年內雙眼錐杆細胞功能完全喪失，導致嬰幼兒先天性盲。先天性黑蒙症佔遺傳性視網膜病變的5%以上，是導致兒童先天性盲的主要疾病（佔10%-20%），多呈常染色體隱性遺傳。

在引起先天性黑蒙症的基因中，發生突變最多的是CEP290、GUCY2D、CRB1、RPE65等基因。特別是，約6%的先天性黑蒙症病例是由RPE65基因突變引起的。2017年12月，美國食品藥物管理局(FDA)批准了Spark公司AAV基因療法，這是一種一次性基因療法，通過AAV病毒載體，將正確的RPE65基因遞送到視網膜細胞，用於治療因雙拷貝RPE65基因突變所致視力喪失但保留有足夠數量的存活視網膜細胞的兒童和成人患者，恢復和改善視力，該療法售價高達85萬美元/年。

2019年1月，基因編輯大神張鋒創立的Editas Medicine公司發表研究稱，其開發的編號為EDIT-101的CRISPR/Cas9基因療法，可恢復Leber先天性黑蒙症10型的視力。2019年7月25 日，Editas Medicine公司和艾爾建（Allergan）聯合宣布：正式啟動CRISPR療法AGN-151587 （EDIT-101）的I/II期臨床試驗。

然而，迄今為止，除了2017年12月獲得美國(FDA)批准的Spark公司的AAV基因療法外，還沒有發現針對先天性黑蒙症的實質性治療或治癒方法。由於這項批准的基因治療方法不能完全糾正突變序列，且在使用AAV時，AAV的載物量有一定的限制

(約4.8 kb)，因此，在基因治療領域，還存在著有待於更廣泛的臨床應用的需求。

2019年10月30日，韓國韓東國際大學（Handong Global University）和首爾國立大學醫學院的研究人員在Science Advances雜誌發表了題為：

CRISPR-Cas9–mediated therapeutic editing of Rpe65 ameliorates the disease phenotypes in a mouse model of Leber congenital amaurosis 的研究論文。

在該研究中，研究人員通過視網膜下注射攜帶CRISPR-Cas9和供體DNA的AAV病毒在rd12小鼠

(人類先天性黑蒙症模型)

中對Rpe65中疾病相關的無義突變進行了CRISPR-Cas9介導的首次治療性校正，並改善了視網膜功能，為開發先天性黑蒙症的治療提供了新的視角。

CRISPR-Cas9技術在短短五年內風靡全球實驗室, 成為了生物科學領域最炙手可熱的研究工具, 可分別通過同源定向修復(HDR)或非同源末端連接(NHEJ)導致基因插入或突變、刪除。雖然HDR的發生頻率普遍低於NHEJ，但HDR永久糾正致病突變的能力對於治療各種遺傳疾病具有巨大的潛力。

CRISPR-Cas9介導的Rpe65的體外編輯

為了使用CRISPR-Cas9技術來治療先天性黑蒙症，研究人員首先使用了來自rd12小鼠的胚胎成纖維細胞(MEFs)來篩選針對Rpe65外顯子3的單導RNA (sgRNA)序列，並最終確定了一個優化的sgRNA序列TS4 sgRNA進一步研究，因為它可以在離提前終止密碼子最近的位點上產生雙鏈斷裂(DSB)，並導致高效的插入或刪除(indel)率。

使用雙AAV系統對Rpe65進行體內基因組編輯

為了評估CRISPR-Cas9介導的疾病模型中Rpe65無義突變編輯的治療效果，研究人員更改了TS4中的一個核苷酸以設計TS4 rd12 sgRNA，該序列與rd12小鼠中Rpe65外顯子3突變位點的序列完全匹配。將所有必需的編輯組件合併到兩個單獨的AAV中（AAV-SpCas9和AAV-TS4 rd12 sgRNA-Rpe65-供體，以下稱為AAV-TS4 rd12-供體），並使用雙AAV系統進行體內遞送。研究人員通過改變其濃度來優化AAV組分的比例，以獲得最大的基因組編輯結果，研究表明在視網膜下遞送比在視網膜遞送更有效，並且Cas9與sgRNA的比例對於優化編輯至關重要。

Rpe65校正的rd12小鼠視網膜功能恢復

為了研究HDR介導的Rpe65基因校正對rd12小鼠的治療效果，研究人員在視網膜下注射AAV後6周和7個月進行黑暗適應後進行了視網膜電圖檢查。AAV處理導致注射後6周視網膜色素上皮細胞中Rpe65表達的恢復。此外，AAV處理導致注射後7個月視網膜色素上皮細胞中Rpe65基因表達的增加。在視網膜電圖中，在視網膜下注射後6周，AAV處理的rd12小鼠在黑暗適應後，對亮刺激（0 dB）產生了明確的響應。初次注射後，電反應可維持7個月，並且視網膜電圖a波和b波分別恢復到了野生型小鼠的21.2±4.1%和39.8±3.2%。這些功能恢復伴隨著解剖學改變，其中HDR介導的Rpe65基因校正阻止了rd12視網膜外核層神經元細胞的丟失。

Rpe65特異性CRISPR-Cas9的全基因組脫靶分析

為了全局表徵TS4 rd12 sgRNA 識別的潛在脫靶位點，研究人員使用rd12小鼠的基因組DNA 進行了Digenome-seq，這是全基因組的無偏脫檢測方法。該分析顯示了幾個潛在的脫靶位點。隨後，研究人員使用靶向深度測序驗證了前29個Digenome-seq潛在脫靶位點。在rd12小鼠的視網膜中，6個基因組位點被證實是TS4rd12 sgRNA的活性靶點，這些所有活躍的脫靶位點均位於內含子或基因間區域。在隨後的脫靶分析中，與TS4 rd12 sgRNA序列相差最多三個核苷酸的所有33個同源位點，在AAV處理的rd12小鼠的預測基因組位點上未觀察到有意義的indel突變。此外，在這些小鼠中7個月內沒有組織學擾動或腫瘤發生。

總的來說，該研究提供了一種基於CRISPR-Cas9的新方法來治療先天性黑蒙症。該研究稱，以前的報導均未在眼科疾病動物模型中顯示體內HDR介導的校正。該研究的永久性基因組編輯治療方法可以單獨使用，也可以與基因治療或蛋白質治療一起使用，以治療先天性黑蒙症。

論文連結：

https://advances.sciencemag.org/content/5/10/eaax1210

相關焦點

  • CRISPR首次編輯人類基因項目將啟動,用於治療失明
    上周在劍橋舉行的EmTech會議上， Editas公司CEO Katrine Bosley 表示，該公司計劃在2017年開啟CRISPR治療失明的臨床試驗。如果Editas執行該計劃，那麼這項研究將是CRISPR編輯人類DNA的首個例子。CRISPR技術發明至今僅有三年，但精確性和廉價性使其傳遍全球生物學實驗室。
  • 基因療法及幹細胞技術擔起治療失明重任 「假如給我三天光明」不再...
    以往，失明患者的治療選擇僅限於電子眼植入物，笨拙、侵入性且昂貴，能在視網膜上產生相當於目前幾百像素的圖像，而正常、清晰的視覺則需要數百萬像素。隨著科學技術的發展，幹細胞技術和基因療法橫空出世，為處在黑暗中的人們帶來的新光明和新希望。千斤之託，不負眾望，幹細胞療法和基因療法在治療失明方面取得的突破讓我們一次次感到驚喜。
  • 改良基因魔剪助力精準治療耳聾 我們離徹底攻克遺傳性疾病還有多遠?
    日前，哈佛醫學院和波士頓兒童醫院的一支聯合研究團隊，利用優化的CRISPR-Cas9基因編輯系統，在耳聾小鼠模型上精確識別並修正內耳的致聾突變，最終幫助小鼠保留聽力，相關研究也同步在線發表在了頂尖學術刊物《Nature Medicine》雜誌上，為無數遺傳性耳聾患者埋下了希望的種子。
  • 基因治療:趨勢與風險
    人類第一次可以通過改變自身的基因治療疾病。　　近年來，基因治療另一個頗受關注的領域是CAR-T細胞治療。CAR-T技術通過在T細胞導入人工的T細胞受體，重新編碼T細胞的功能，使其獲得識別腫瘤抗原和殺傷癌細胞的能力。2017年，美國FDA腫瘤藥物諮詢委員會以10:0的投票結果，一致推薦批准諾華公司的CAR-T細胞療法，用於復發或難治性的B細胞淋巴瘤。
  • 新英格蘭: CRISPR–Cas9基因編輯有望治療鐮狀細胞性貧血和β-地...
    1949年，Linus Carl Pauling（萊納斯·卡爾·鮑林）發現鐮狀細胞性貧血是一種「分子疾病」，是由於血紅蛋白的變異，說明人的遺傳性疾病是由於突變基因表達所產生的異常蛋白質，首次提出了分子疾病的概念。這為在分子水平上檢查遺傳性突變奠定了基礎，也讓他成為分子生物學的鼻祖。
  • 五國科學家發現新致盲基因 首次與人類疾病關聯
    7月30日，來自美國Casey眼科研究所、深圳華大基因研究院、浙江大學醫學院第一附屬醫院等中、美、加、澳和巴西五國多個單位的研究人員，聯合發現了一個新的萊伯氏先天性黑蒙（Leber congenital amaurosis，LCA）致病基因NMNAT1，並首次將NMNAT1基因突變與人類疾病相關聯起來，為罕見
  • 專家稱理論上癌症有可能通過基因編輯治療
    外界認為，這篇研究論文的發表，意味著世界首例通過基因編輯幹細胞治療愛滋病和白血病患者的案例由中國科學家完成了。浙江大學醫學院基因組醫學專業祁鳴教授對記者說，基因編輯和基因治療的探索，將為很多重大疾病提供新的治療路徑。
  • 張鋒公司使用CRISPR基因編輯治癒先天性失明 FDA已批准其臨床試驗
    該研究使用Editas Medicine公司開發的編號為EDIT-101的CRISPR/Cas9基因療法，該療法巧妙地去除由CEP290基因中的IVS26突變產生的異常剪接供體，從而恢復正常的CEP290基因表達，成功恢復了Leber先天性黑蒙症10型的視力。這一成果也表明基於CRISPR的基因編輯療法在治療遺傳疾病方面的可行性。
  • Blood:一種先天免疫性缺陷疾病被基因治療100%治癒
    這些基因治療的細胞一直穩定存活在所有患者體內。在此期間，年人嚴重感染事件從1.17次下降到0.17次，患兒體內免疫得到良好的重建。試驗的註冊號為NCT00598481.這是人類基因治療的創舉，意味著未來5000餘種單基因疾病都可能採用類似的治療策略而徹底治癒。腺苷脫氨酶缺乏病，到底是什麼樣的疾病呢，可以從一個故事說起。
  • 陸英明點評 | 基因療法：眼部疾病治療革新者
    這些數據表明，該研究找到了一種能使雙極細胞替代受損光感受器工作的方法，為視網膜退化的潛在治療提供了一個新的切入點。 與早期研究的病毒載體相比，目前基因治療中常用的AAV在眼睛中具有廣泛的向性和低免疫原性。而有限大小的玻璃體空間可有效轉導視網膜細胞信號，為AAV向視網膜細胞輸送正常基因提供了有利的環境。
  • 基因治療新突破,病毒性角膜炎有望根治
    HSV包括HSV-1和HSV-2兩種血清型，其中，HSV-1的感染可引起多種疾病，包括眼角膜感染引起的皰疹性基質性角膜炎（HSK），後者是導致感染性失明的首要原因。雖然部分病毒性角膜炎患者能通過接受角膜移植恢復透明，但HSV-1在角膜上皮原發性感染並生產複製後，會通過眼神經逆行到達三叉神經節，在那裡建起一個病毒貯庫。一旦重新激活，疾病便會復發和惡化。
  • 遺傳病學的分類及治療方法
    遺傳病的概念及分類遺傳病指由於遺傳物質改變所導致的疾病，主要包括染色體疾病和基因病，染色體疾病主要是因為染色體異常所導致，如三體症候群，即通常所說的唐氏症候群；基因病又有單基因病和多基因病之分，單基因病即單個基因異常導致的疾病，如先天性耳聾、白化病、血友病等，多基因病即多個基因發生異常導致的疾病，如高血壓、糖尿病等。
  • 美國第一個針對遺傳病的基因療法有望上市:為失明者揭開黑布
    RPE65由此成為萊伯先天性黑蒙症第二個被發現的致病基因，所以該基因出現問題的患者也被稱為LCA2型患者。LCA2型是至今發現的22個致病基因中最常見的類型之一，約佔總患者的6%。左為LCA患者，右為健康人。兩者的視網膜對比，LCA患者的血管組織更少，視網膜更薄，黃斑有所變化，沒有中央暗斑。
  • 基因治療的投資要素分析
    前言Preface文 l 郭佳腺相關病毒（AAV）載體介導的基因治療藥物被批准用於遺傳性失明和脊髓性肌萎縮的治療，對其他罕見疾病，包括血友病和杜氏肌營養不良，也取得了很好的治療效果。在本文中，我們將討論如何通過「載體工程」來增強AAV載體的轉導效率（基因表達盒工程）、載體向性（衣殼工程）、克服患者的免疫障礙，以及提升AAV的產量，此外介紹預測AAV基因治療藥物臨床試驗中轉導率的方法。一AAV載體和基因治療AAV是一種單鏈DNA細小病毒，其基因組包括rep基因和cap基因，兩側有兩個末端反向重複序列(ITRs)。
  • 專家「臍」談丨陳靜:臍帶血為先天性遺傳代謝病治療打開新思路!
    遺傳代謝病是有代謝功能缺陷的一類遺傳病，造血幹細胞移植是治療此類疾病的有效手段之一。隨著臨床科研的進展，臍帶血已為先天性遺傳代謝病的治療打開新思路。在剛剛閉幕的第八屆臍帶血大會上，上海兒童醫學中心血液/腫瘤科陳靜教授為我們講解了臍帶血在治療先天性遺傳代謝病方面的成果及優勢。
  • PNAS:科學家首次識別視神經幹細胞,為治療失明帶來希望
    正文   科學家首次識別出視神經幹細胞，或者治療視力喪失。   目前，大約有300萬美國人患有青光眼，並因此導致12萬患者失明。青光眼是由視神經受損引起的疾病，這種神經損傷通常與眼內房水無法正常排出，導致眼內壓力升高有關。隨著時間的推移，患者的視覺盲點會逐漸擴大。
  • 「三問」基因編輯 中國科學家提出安全檢測新方法
    中新網上海3月1日電 題：「三問」基因編輯 中國科學家提出安全檢測新方法　　作者 鄭瑩瑩　　因為「基因編輯嬰兒」事件，基因編輯被視為敏感的生物醫學新技術。人類是否需要基因編輯？什麼樣的基因編輯技術可行？怎樣檢測技術安全性？
  • 【綜述】治療性CRISPR/cas9技術研究進展
    因此，這種方法造成的基因組改造可以遺傳到子代個體中，為消除家族性的遺傳疾病提供可能。上海生化細胞所的李勁松研究員首次報導用 Crispr/cas9 技術修復小鼠胚胎中引起疾病的突變基因。他們矯正了小鼠白內障顯性突變基因 Crygc。
  • 第二節 基因治療的方法
    這種方法簡單，但效率極低，一般1000－100000個細胞中只有一個細胞可結合導入的外源基因。要達到治療目的，就需要從病人獲得大量所需的受體細胞。當然，可以通過選擇培養的方法來提高轉化率。 　　2）物理法：包括電穿孔法和直接顯微注射法。
  • 遺傳性視網膜疾病基因治療將何去何從?
    Leber先天性黑矇（Leber's congenital amaurosis, LCA）對於患者來說是一種極其痛苦的致盲眼疾。請您簡要介紹一下基因治療LCA的原理和方法，並談談設立此研究的初衷？我們知道，評價臨床治療效果的金標準是RCT和Meta分析，因此，我團隊的王雪博士就對已經發表的文章進行了系統評價，以便更好地了解人類LCAⅡ基因治療的有效性。基因治療的原理和方法比較簡單，就是通過視網膜下腔注射攜帶RPE65編碼序列的腺相關病毒載體，彌補視網膜色素上皮細胞RPE65基因缺陷，維持正常的視循環，最終達到治療目的。