基因治療病毒載體有毒？這種方法可降低對神經細胞的毒性

2020-11-26 知識分子

圖源：Pixabay


撰文丨蛋炒飯

責編丨戴 威


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隨著生命科學與醫學的發展，基因治療逐漸走進人們的視野。基因治療主要是針對那些難以用化學藥物根治的、對人類健康存在威脅的疾病，包括遺傳病（如脊肌萎縮症、地中海貧血症）、惡性腫瘤、心血管疾病、阿爾茨海默症與免疫缺陷等。


目前，許多體內基因治療的方法都是以腺相關病毒（AAV）為載體。腺相關病毒是一種結構簡單的單鏈DNA缺陷型病毒，通常需要輔助病毒的幫助才能複製。基因治療通常將腺相關病毒內部編碼病毒蛋白的DNA刪掉,然後治療性的轉基因或基因編輯工具包裝進腺相關病毒，隨後通過病毒將之遞送至患者靶細胞內最終進入細胞核，取而代之的是治療性轉基因，從而實現基因治療。


雖然AAV在應用於基因治療時具有諸多優點，但在治療神經系統遺傳疾病時有潛在的致病性，會導致新的問題。已有的研究表明，無論是將AAV載體通過靜脈注射入豬的血液中 [1]，還是將其通過小腦延髓池穿刺（ICM）注入非人靈長類動物的腦脊液中[2,3]，都會對動物的背根神經節（DRG）產生嚴重毒性，這種毒性會導致神經退行性疾病，嚴重時甚至可產生共濟失調症。


針對此問題，來自美國賓夕法尼亞大學的詹姆斯·M·威爾森（James M·Wilson）教授開發出一種新的方法，避免在使用AAV作為載體治療此類疾病時對背根神經節的毒性。該方法於11月11日發表在《科學-轉化醫學》（Science Translational Medicine）雜誌上 [4]。

為什麼AAV載體對背根神經節有毒？


圖1. 小腦延髓池穿刺注射AAV後，可在非人靈長類中引發背根神經節毒性與繼發的軸突病變。圖源：[4]


我們先來了解一下背根神經節為什麼會因AAV載體 「中毒」。背根神經節是一種聚集在脊髓外側的感覺神經元（圖1.A），對AAV載體有著特殊的親和力。因此，這些神經細胞被過多AAV載體轉導後會進行超負荷的轉錄和蛋白合成，導致細胞應激，使衛星細胞反應性增殖並分泌細胞因子，繼而吸引淋巴細胞，這一連串反應最終會導致細胞死亡（圖2）。


圖2. AAV蛋白過表達介導的背根神經節毒性模型。圖源：[4]


「隨著我們在基因治療領域的不斷進步，尤其是在治療非致命性疾病方面的進步，我們會有一些安全顧慮，而這些安全顧慮將超過通過治療收穫的益處」，本研究的通訊作者威爾森說。[5]


雖然藥物可以減輕機體對AAV載體和轉基因產物的免疫反應，但並無法消除其對背根神經節的毒性和軸突病變 [2,3]。那麼，是否可以通過某種方法來使這種情況得到改善呢？


為此，威爾森團隊設計了一種新的方法，從而大大降低AAV載體對這種神經細胞的毒性。


既然超負荷轉錄有毒，那就讓AAV載體別表達了


結合早期嘗試與對各種方法的評估，作者最終選定了以下方案：讓背根神經節中的AAV載體沉默。


怎麼才能讓背根神經節精準識別出AAV載體並阻止其表達呢？研究者決定在AAV載體中插入的特殊基因片段。我們知道，當一般的編碼DNA想行使其功能時，會先轉錄為單鏈mRNA（信使RNA），才能被翻譯為蛋白質。不過，miRNA（微小RNA）可以與其互補配對的mRNA的特定區域特異性結合，這樣一來，mRNA就形成了部分雙鏈，而這樣的mRNA會被機體降解掉，從而阻止其繼續翻譯成蛋白質。


圖3. 在載體中插入特異性miRNA靶序列可對蛋白過表達進行沉默。圖源：[4]


因此，研究團隊在轉基因的終止密碼子和poly-A尾之間插入與背根神經節中特有miRNA反向互補的四個重複序列（圖3）。如此一來，當AAV攜帶的轉基因轉錄為mRNA，如果miRNA找到鏈條中與其互補的序列並與之結合，基因表達就終止了。四個重複序列可以增加其與背根神經節中特異miRNA結合的概率，繼而加強其抑制效率，組成一個用於在背根神經節中沉默AAV的表達盒（expression cassette）。這樣的表達盒不僅可以通過miRNA的特異性識別來沉默轉基因在背根神經節中的表達，而且在其它不表達特異性miRNA的細胞類型中，蛋白質合成也不會受到影響。


作者最終選擇了一個在背根神經節中特異性很高的 miRNA183（簡稱miR183）的反向重複序列作為表達盒的插入序列。


表達盒設計好了，它的療效如何呢？


插入新片段的AAV載體，基因治療效果如何？


研究團隊首先用恆河猴測試了在AAV載體加入特定片段後，是否會減輕對背根神經節的毒性。通過小腦延髓池穿刺，研究人員將表達GFP（綠色螢光蛋白）或 GFP-miR183 的AAV載體注射進成年恆河猴體內，在第14天對半數動物進行屍檢，檢測GFP的表達量；在第60天處死剩餘動物，評估GFP的表達量與背根神經節毒性。並且，猴子們在接受AAV注射後，均沒有證據表明其獲得神經性頭痛等臨床後遺症。


圖4. miR183靶位點的插入特異性沉默了背根神經節中GFP的表達。圖源：[4]


結果如圖4所示，含有miR183靶標的改造載體與對照載體相比，螢光蛋白的表達量在背根神經節中顯著降低，而在腰椎運動神經元和小腦中顯著提高，在大腦皮質中則無明顯變化。這些現象意味著，含有miR183靶序列載體的蛋白表達僅在背根神經節中受到了抑制，而在其它神經組織中並未受到抑制。並且當載體中不含有miR183靶位點時，所有區域都存在病理現象。


之後，研究團隊測試了加入特定序列後，AAV載體的基因治療效果如何。作者使用了表達hIDUA的載體進一步評估了在非人靈長類中miR183靶序列的作用。hIDUA是黏多糖病I型患者體內缺乏的酶，有關這一基因的研究首次報導了非人靈長類中的背根神經節毒性 [3]。


實驗分為三組，第一組動物僅注射表達hIDUA的載體；第二組在第一組的基礎上加入類固醇藥物進行治療；第三組在表達hIDUA的載體中整合入miR183靶序列。在第90天處死所有動物，評估hIDUA的表達量與背根神經節毒性。


圖5. miR183靶位點的插入特異性沉默了背根神經節中hIDUA的表達。圖源：[4]


結果顯示，在第一組和第二組的背根神經節中檢測到hIDUA的高表達量，在其中樞神經系統的其它區域檢測到低至中度的hIDUA表達。而在第三組中，將miR183靶序列整合入載體後，不僅阻斷了背根神經節中hIDUA蛋白的表達，且中樞神經系統中hIDUA蛋白的表達量沒有降低。第三組動物在背根神經節、脊柱和周圍神經區域完全沒有出現病理現象，而第一組和第二組動物則恰恰相反、存在病理現象。


以上數據與現象共同說明，研究團隊開發的方法可以在非人靈長類中減輕基因治療過程中AAV載體誘導的背根神經節毒性，並且在此基礎上不會降低基因治療的效果。


技術已授權，或有助於臨床治療


「我們能夠在保證病毒載體效力的情況下降低或消除其背根神經節毒性」，威爾森說，「基因治療目前正在對21種不同的疾病進行臨床試驗，另有122種疾病正在進行臨床前研究。在這21種正在進行臨床試驗的治療中，有14種可能具有背根神經節毒性，而這種改良的AAV載體可能會使該現象有所改善。」 [5]


威爾森的研究小組已經同意將這項技術授權給五家基因治療公司，並正在與另外五家公司進行談判。這種改良技術目前並未應用於臨床，但作者說他希望明年就能實現對此技術的臨床應用。


「這項研究使AAV基因治療向臨床應用邁出重要的一步。」 來自南安普頓大學神經再生領域的科學家梅利莎·安德魯斯（Melissa Andrews）這樣評論該研究，「這種方法看起來並不會降低基因治療的療效，而且作為一種更為安全的治療措施，它將受到臨床治療的歡迎。」 [5]


參考資料：

[1]C. Hinderer, N. Katz, E. L. Buza, C. Dyer, T. Goode, P. Bell, L. K. Richman, J. M. Wilson.(2018).Severe toxicity in nonhuman primates and piglets following high-dose intravenous administration of an adeno-associated virus vector expressing human SMN. Hum. Gene Ther. 29, 285–298.

[2]J. Hordeaux, C. Hinderer, T. Goode, E. L. Buza, P. Bell, R. Calcedo, L. K. Richman, J. M. Wilson.(2018).Toxicology study of intra-cisterna magna adeno-associated virus 9 expressing iduronate-2-sulfatase in rhesus macaques. Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 10, 68–78.

[3]J. Hordeaux, C. Hinderer, T. Goode, N. Katz, E. L. Buza, P. Bell, R. Calcedo, L. K. Richman, J. M. Wilson.(2018).Toxicology study of intra-cisterna magna adeno-associated virus 9 expressing human alpha-L-iduronidase in rhesus macaques. Mol. Ther. Methods Clin. Dev.10, 79–88.

[4]Juliette Hordeaux, Elizabeth L. Buza, Brianne Jeffrey, Chunjuan Song, Tahsin Jahan, Yuan Yuan, Yanqing Zhu, Peter Bell, Mingyao Li, Jessica A. Chichester, Roberto Calcedo, James M. Wilson.(2020).MicroRNA-mediated inhibition of transgene expression reduces dorsal root ganglion toxicity by AAV vectors in primates. Sci. Transl. Med.12, eaba9188

[5]https://www.statnews.com/2020/11/11/gene-therapy-james-wilson-nerve-aav/



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