如何做蛋白亞細胞定位實驗？

2020-09-04 伯遠生物

生物功能的區域化是生命的一種基本現象，這種區域化是通過不同層次的系統組成，從器官到特異細胞，再到細胞內部的亞細胞結構，最後到大分子複合物。在細胞水平，蛋白在特定的時間和空間發揮作用，這種區域化的定位為蛋白發揮作用提供特定的化學環境以及所需的互作因子等。蛋白的錯誤定位容易導致細胞活動的紊亂。因此，了解蛋白的亞細胞定位對於研究基因的功能、蛋白互作及其作用機理是必要的。

Fig. 人體細胞內的亞細胞結構。Peter J. Thul et al.， Nature. 2017.編輯

研究蛋白亞細胞定位的方法有哪些？

1、計算機預測，可使用UniProt資料庫（https://www.uniprot.org/）

2、螢光蛋白原位鑑定

3、免疫螢光標記

4、定量色譜，可以鑑定細胞內在梯度電泳中分布相似的或通過酶切處理標記的蛋白

小編推薦第二種方法，是近年來分子生物學實驗最常用的方法之一，下面我們來看看方法二吧！

概念是什麼？

採用瞬時轉化技術，利用雷射共聚焦顯微鏡（Confocal microscopy）觀測某種蛋白在細胞內的具體位置，例如在細胞核內、細胞質內、細胞膜或細胞器上。

原理是什麼？

將目標基因與螢光蛋白的N端或者C端融合，通過瞬時轉化技術使該融合蛋白在受體材料細胞內表達，通過觀察螢光蛋白在細胞內顯示的位置確定目標蛋白的位置，從而確定目標蛋白的亞細胞定位情況。

適用於什麼實驗場景？

1. 基因功能研究，paper裡總少不了這一項

2. 研究蛋白相互作用，與酵母雙雜實驗結果相互驗證

同時2有個單獨的名字——雙分子螢光互補技術（Bimolecular fluorescence complementation，簡稱BiFC），將螢光蛋白分割成兩個不具有螢光活性的分子片段，再分別與目標蛋白連接。若兩個目標蛋白因為有相互作用而接近，就使得螢光蛋白的兩個分子片段在空間上相互靠近，重新形成活性的螢光基團而發出螢光。

Fig. BiFC原理圖編輯

實驗方法

按實驗材料的不同分為三類：

一、原生質體

構建載體→製作原生質體+轉化質粒→雷射共聚焦顯微鏡觀察編輯

二、菸草葉片

構建載體-農桿菌轉化-注射菸草葉片-雷射共聚焦顯微鏡觀察

三、動物細胞

構建載體-轉化質粒-雷射共聚焦顯微鏡觀察

敲黑板 劃重點：共定位實驗，一定要選用文獻已發表的做過亞細胞定位的蛋白作為對照哦！

常見的問題

原生質體轉化效率低，需要注意水浴的溫度，適宜的溫度可以起到事半功倍的作用。

菸草瞬時轉化常見的問題：

1. 轉化效率低：需注意農桿菌的活性，建議侵染菸草葉片的農桿菌OD600值為0.6；

2. 生長4-5周的菸草苗比較適合注射。

原生質體瞬時轉化的注意事項：

1. 原生質體非常脆弱敏感，操作需輕緩，環境培養溫度要求嚴苛；

2. W5溶液是維持細胞滲透壓最關鍵的溶液：濃度過高，細胞會癟；濃度過低，細胞會破；

3. W5溶液的最適為pH5.7-5.8；

4. 苗齡過高或育苗時水分不足會產生較多的澱粉粒；

5. 細胞經過多次洗滌，在洗滌轉移上清液時，槍頭要從上部輕輕吸取，儘量減少細胞震蕩，避免細胞損失。

亞細胞定位不亮的原因（相對於老師自己寄送材料而言）：

1. 質粒問題：質粒濃度不夠；質粒已降解；空載體自身的轉化效率不高；

2. 目的蛋白和螢光蛋白的相對位置；

3. 載體構建問題：所構建的載體中螢光蛋白是否移碼；目標基因是否去除終止密碼子（gene-GFP）；目標基因是否包含ATG啟動子（GFP-gene）；

4. 物種差異；

5. 目標蛋白空間摺疊的問題，如果目標蛋白較大會將螢光蛋白包裹起來，建議用Linker隔開；

6. 有些目的蛋白包含信號肽，若構建螢光蛋白-目的蛋白的形式，是會影響定位情況或直接導致沒有螢光。

我們公司的技術優勢

成熟的單雙子葉原生質體瞬時轉化平臺

無縫連接排除非必要序列幹擾

擁有全套各色細胞器Maker

低質粒濃度的高效轉化

穩定，可重複性高

高分辨、高質量圖片結果

快速、高效，我司擁有自行購置的Confocal儀器，每年做至少三千個項目，一周之內可看結果

能做哪些材料

植物：我司常備水稻、菸草、小麥、大麥、玉米、擬南芥的原生質體、菸草葉片

有以下細胞器的Marker：細胞核，質膜，液泡膜，內質網，高爾基體，過氧化物酶體，葉綠體，線粒體

可選螢光蛋白：GFP，YFP，mCherry，mKate

動物：我司常備293T細胞、Hela細胞，其他細胞也可。

有以下細胞器的Marker：細胞核、線粒體、細胞膜、內質網、高爾基體、過氧化物酶體

可選螢光蛋白：綠色和紅色螢光

伯遠案例

伯遠生物植物亞細胞定位


伯遠生物動物亞細胞

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