實驗專欄丨大神教你如何細胞計數

2021-01-13 中洪博元醫學實驗幫

 提示：點擊上方"中洪博元"↑免費訂閱本刊

科研工具| 作圖| 實驗 | SCI |統計分析


細胞培養技術中，細胞計數是一項基本功，對於標準化培養條件以及需要精確定量的實驗來說都非常關鍵。這裡介紹使用血細胞計數器對細胞進行計數的經典方法以及中間一些需要注意的細節。



對於貼壁生長的細胞，我們需要首先使用胰酶消化的方法使細胞從培養皿表面脫落


根據需要加入合適體積的培養基，將細胞進行中和及稀釋，以得到均質的細胞懸液。要求儘可能將細胞吹打散開，不要殘留任何細胞團



使用70%乙醇將蓋玻片和血細胞計數器清潔乾淨；


將將蓋玻片潤溼（使用水或呼一口氣，目的是使蓋玻片與血細胞計數器接觸更緊密，易於粘連），並覆蓋至血細胞計數器上；



如果需要計算細胞的活力，則需要將細胞懸液和0.4%臺盼蘭等體積混合


室溫孵育3-5分鐘，使臺盼蘭完全進入死細胞，使死細胞著藍色



使用吸管將細胞懸液或細胞/臺盼蘭混合液滴加到血細胞計數器計數池的邊緣。此時液滴將在虹吸的作用下進入蓋玻片下方的計數池


以同樣的方式在另一側的計數池中也加入細胞懸液


將計數板放置幾分鐘使細胞完全擴散，同時用吸水紙吸除多餘的液體



在100倍顯微鏡下，移動計數板將視野對準計數板的中央大方塊，該方塊四周有一圈3條平行線包圍，中間有密集的網格。中央方塊區差不多剛好可以填滿整個視野（下圖中標記的3號位置）


使用手持式計數器記錄計數池四個角以及中央方塊內的細胞數（1-5號位置，經典的current-protocol推薦每個方塊細胞數應不大於20-50），並重複記錄另一側計數池中的細胞數，總計十個方塊。計數的方法是只計算上邊和左邊壓線的細胞，而右邊和下邊壓線的細胞不予計算（下圖，總體原則是「計上不計下，計左不計右」，判斷標準為是否接觸三條邊線的中間線）。如果有多個細胞沒有吹散成團存在，此時只可記為一個細胞。如果團塊很多，則可能需要重新吹打甚至消化直至絕大多數細胞為單個細胞


血細胞計數器計數原則



血細胞計數器的機構示意圖


由血細胞計數器的構造可以看出，血細胞計數器每個大方塊可以容納的體積為：


1 mm2×0.1 mm = 0.1 mm3 = 10-4 cm3 = 10-4 ml


也即每個大方塊的體積為萬分之一毫升，因此在計算每毫升液體中的細胞數時需要乘以104。


在常規沒有使用臺盼蘭染色時，可以以下面公式計算每毫升培養基中細胞的個數：


每毫升培養基中細胞的個數 = 每個方塊內細胞的平均數 × 細胞稀釋比例 × 104


如何使用了臺盼蘭染色，還需要計算活細胞的比率：


活細胞比率 = 臺盼蘭拒染細胞數 / 總細胞數



每毫升培養基中活細胞的個數 = 每個方塊內細胞的平均數 × 活細胞比率 × 細胞稀釋比例 × 2 × 104


註：乘2是由於在臺盼蘭染色時，進行了等體積混合，相當於稀釋了一倍。

關於細胞實驗還有很多問題需要解答，怎麼辦？

加入中洪實驗群組，為你排憂解難！


 目前的群組有：

【細胞實驗交流群】

【動物實驗互助交流群】

【WB實驗交流群】

【基因敲除技術交流群】

【基礎實驗技術交流群】

【腺病毒慢病毒實驗交流群】

【PCR實驗交流互助群】

【醫學科研資源整合群】

如何進群：長按二維碼添加小編微信：boyuan6668並備註好你的研究方向+姓名+想要進入的群組（未備註以上信息者將不會拉入任何群組），小編會在24小時內拉你入群哦！


相關焦點

  • 實驗技術篇|如何提高細胞計數的準確性
    ，但最為操作麻煩，甚至讓你有點崩潰的便是細胞計數額，尤其是一連做七八個對照組的時候！（饅之瘋狂哭泣） 這個實驗的簡單之處在於：全程無腦傻瓜操作，所需的材料廉價可得，整個過程中絕對不會涉及到因為試劑的問題影響實驗。全看自己操作的可不可。 這個實驗的難點之處在於：每一次細胞的消化，細胞的處理，不同的細胞，甚至細胞混勻之後吹打的問題都會影響實驗計數的結果。
  • 實驗專欄丨細胞生長緩慢,怎麼破?
    科研工具| 作圖| 實驗 | SCI |統計分析  細胞生長緩慢是實驗人員在培養細胞時常遇見的問題，那麼究竟是哪些因素影響？又如何改善？今天中洪君就給你答疑解惑——1、檢查你所培養的細胞是否存在汙染。（A）如果培養細胞未添加抗生素(必須添加？),細胞汙染則是可能出現的。（1）用肉眼和顯微鏡進行檢查（2）如果細胞被汙染則要棄掉。
  • 實驗專欄丨石蠟切片和冰凍切片——傻傻分不清楚
    科研工具| 統計分析| 實驗 | SCI寫作 | PPT在組織實驗中，石蠟切片和冰凍切片是最常見的兩種切片方法，兩種優缺點明顯，在實驗的應用上也大有不同。而兩個實驗的相同點都是應用免疫學基本原理——即抗原與抗體特異性結合的原理，通過化學反應使標記抗體的顯色劑顯色來確定組織細胞內蛋白質，對其進行定位、定性及相對定量的研究。
  • 細胞計數方法------細胞計數板法
    實驗原理：當待測細胞懸液中細胞均勻分布時，通過測定一定體積懸液中的細胞的數目，即可換算出每毫升細胞懸液中細胞的細胞數目。具體操作：1. 將計數板及蓋片擦拭乾淨，並將蓋片蓋在計數板。2.為了保證計數的準確性，避免重複計數和漏記，在計數時，對沉降在格線上的細胞的統計應有統一的規定。如菌體位於大方格的雙線上，計數時則數上線不數下線，數左線不數右線，以減少誤差。即位於本格上線和左線上的細胞計入本格，本格的下線和右線上的細胞按規定計入相應的格中。見下圖：即本格中計數細胞為3個。
  • 微生物細胞數的計數——萬融實驗
    計算方法如下：1．16×25的計數板計算公式細胞數／ml：100小格內的細胞數／100×400×10×1000×稀釋倍數。2．25×16的計數板計算公式細胞數／ml：80小格內的細胞數／80×400×10×1000×稀釋倍數。四、操作步驟（1）稀釋樣品，為了便於計數，將樣品適當稀釋，使每格約含5個細胞。
  • 懶人神器教你如何細胞計數,告別血平板和計數器
    上一回，我們講了如何用ImageJ計算細胞劃痕面積，有很多同學後臺留言，問各種應用，例如細胞計數
  • 細胞計數和活力測定實驗方法
    改良的Neubauer血細胞計數器; 　　4. 計數器蓋玻片; 　　5. 袖珍管或等體積的塑料容器，如試管或離心管; 　　6. 巴斯德吸管(短型和長型); 　　7. 可調體積的微量加樣器(100—250μl); 　　8. 無菌槍尖; 　　9.
  • 實驗專欄丨SmaterRace新技術,一起get
    cDNA末端快速擴增技術(rapid amplification of cDNA ends, RACE)是基於PCR技術由已知的部分cDNA序列來獲得完整的cDNA全長序列的一種實驗方法，該技術由Frohman等人在1988年首次提出。
  • 細胞計數竟如此簡單
    細胞計數是細胞實驗中非常重要的一個環節，科研工作者需要從多方面對培養的細胞進行分析
  • 微生物實驗中 細菌計數的方法
    在微生物實驗中，細菌計數的實驗方法主要有以下幾種： 　　1、計數器測定法 　　即用血細胞計數器進行計數。取一定體積的樣品細胞懸液置於血細胞計數器的計數室內，用顯微鏡觀察計數。由於計數室的容積是一定的(O.1mm3)，因而根據計數器刻度內的細菌數，可計算樣品中的含菌數。本法簡便易行，可立即得出結果。
  • 實驗專欄丨成骨細胞誘導實驗細節曝光,先睹為快!
    科研工具丨作圖丨實驗丨SCI丨統計分析丨國自然培養器皿表面的明膠包被：為了避免誘導過程中MSCs出現漂浮現象，建議對成骨誘導使用的培養器皿表面進行明膠包被。4、30 min後棄去明膠，待培養器皿晾乾後，即可用於接種細胞。另：包被明膠的培養器皿在無菌和明膠不蒸乾的條件下，可以在4℃保存兩周。
  • 細胞計數
    ，如用酶消化製備的細胞懸液中細胞活力的鑑別，凍存細胞復甦後的活力檢測等。細胞懸液製備後，常用活體染料臺盼藍對細胞進行染色，由於臺盼藍不能透過活細胞正常完整的細胞膜，故活細胞不著色。而死亡細胞的細胞膜通透性增高，可使染料進入細胞內而使細胞著色（藍色）。而當進行細胞計數時一般用血細胞計數板，同時可以確定細胞的生活狀況。
  • 培養細胞的形態觀察和計數
    【實驗目的】了解培養中的動物細胞的一般形態和生長狀態；掌握細胞計數的基本方法。【實驗用品】一、材料和標本 培養中的 HeLa 細胞(人子宮頸癌上皮細胞)、NIH3T3(小鼠成纖維細胞)、HL60 細胞(人白血病細胞)二、器材和儀器 倒置顯微鏡、細胞計數板、普通光學顯微鏡、乳頭吸管三、試劑 0.3％臺盼蘭染液、0.25％胰蛋白酶一0.02％EDTA 混合消化液【實驗內容】一、培養細胞的形態觀察
  • 實驗專欄丨檢測細胞毒性實驗對比
    首先我們來看一下CCK8與MTT的實驗原理。CCK-8實驗：實驗原理：全稱為Cell Counting Kit-8，在電子載體1-Methoxy PMS存在的情況下能夠被細胞內脫氫酶還原成水溶性的甲臢染料，生成的（橙黃色）甲臢量與活細胞數量成正比，即顏色的深淺與細胞的增值成正比。
  • 讓細胞計數更加準確的7個步驟 | 單細胞專題
    對於每種細胞計數方法，樣品表面必須是乾淨的。任何汙染都可能導致不準確的結果。對於人工細胞計數，這包括移除和清潔玻璃蓋片，然後用70%乙醇然後用水清潔計數腔。不同大小和類型的細胞將以不同的速率沉降和聚集。在加載樣品之前立即旋轉溶液會增加等分的概率，並準確地反映細胞培養的特性。細胞計數需要對整個細胞懸液中的少量樣本進行分析，因此必須注意確保樣品能夠代表原始整個單細胞懸液。
  • 細胞計數及活力測定實驗方法及步驟詳解
    一、細胞計數 1.  將血球計數板及蓋片用擦試乾淨，並將蓋片蓋在計數板上。 2.  將細胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計數板之間。 3.  靜置3分鐘。 4.  鏡下觀察，計算計數板四大格細胞總數，壓線細胞只計左側和上方的。然後按下式計算： 細胞數/ml=4大格細胞總數/ 4×10 000 注意：鏡下偶見由兩個以上細胞組成的細胞團，應按單個細胞計算，若細胞團佔10%以上，說明分散不好，需重新製備細胞懸液。
  • 怎麼進行細胞計數?
    比如，50%細胞融合是指一半的培養皿/瓶等的表面被細胞覆蓋。對於懸浮細胞，通常用細胞系或類型的細胞密度衡量其生長過程，但或許也可通過濁度增加和培養基顏色穩定評估「融合「。培養中的細胞生長一般發生在四個階段，如圖所示，隨著時間推移的細胞計數的對數形成一個S型曲線(S-型)，不同細胞系和培養物在每個階段需要的時間有很大差異。
  • 實驗專欄丨如何建立大鼠體外循環模型?
    科研工具丨作圖丨實驗丨SCI丨統計分析丨國自然體外循環(cardiopulmonary bypass
  • get 小技能——細胞計數ing
    把培養細胞的培養皿（或培養瓶）放在顯微鏡下，選擇合適倍數的物鏡，先後調節粗準焦螺旋/細準焦螺旋，就可以觀察細胞了，細胞的密度也就盡在掌握中了。很簡單～你開始培養時，接種了多少個細胞？你養了3天的細胞現在大約有多少個？和最初接種時相比，增加了多少的量？你要凍存的細胞數量有多少？這個就不能直接通過觀察就能看出來了，需要實實在在地一個一個地數。怎麼數呢？
  • 科研 | 血球計數板細胞計數
    而最近自己也有使用血球計數板對細胞進行計數，發現計數方法並不是全國統一。首先介紹血球計數板的構造：血球計數板上有5條較深的半圓形凹槽（如圖A所示），其中3條構成呈「H」形（圖B所示），將血球計數板中部分為上下兩區域。這兩個區域都可以進行細胞計數，即一塊板可同時進行兩次計數。