微生物細胞數的計數——萬融實驗

2021-01-08 實驗室小知識

一、目的

了解血球計數板的結構，掌握使用和計算方法。

二、儀器與材料

顯微鏡、血球計數板、移液管、酵母菌液（準備見附錄）。

三、血球計數板的結構和計算方法

血球計數板由一塊比普通載玻片厚的特製玻片製成。玻片中央刻有四條槽，中央兩條槽之間的平面比其他平面略低，中央有一小槽，槽的兩邊的平面上各刻有9個大方格，中央的一個大方格為計數室，其長和寬各為1mm，深度為0.1mm，其體積為0.1mm3。計數室有兩種規格：一種是把大方格分成16中格，每一中格分成25小格，共400小格；另一種規格是把大方格分成25中格，每一中格分成16小格，總共也是400小格。計算方法如下：

1．16×25的計數板計算公式

細胞數／ml：100小格內的細胞數／100×400×10×1000×稀釋倍數。

2．25×16的計數板計算公式

細胞數／ml：80小格內的細胞數／80×400×10×1000×稀釋倍數。

四、操作步驟

（1）稀釋樣品，為了便於計數，將樣品適當稀釋，使每格約含5個細胞。

（2）取乾淨的血球計數板，用厚蓋玻片蓋住中央的計數室，用移液管吸取少許充分搖勻的待測菌液於蓋玻片的邊緣，菌液則自行滲入計數室，靜置5～10分鐘即可計數。

（3）將血球計數板置於載物臺上，用低倍鏡找到小方格後換高倍鏡觀察計數。需不斷地上、下旋動細調節器，以便看到計數室內不同深度的菌體。現以16×25規格的計數板為例，數四個角（左上、右上、左下、右下）的四個中格（即100小格）的酵母菌數。如果是25×16規格的計數板，除取四個角上四中格外，還取正中的一個中格（即80小格）。對位於大格線上的酵母菌只計大格的上方及左方線上的酵母菌，或只計下方及右方線上的酵母菌。

每個樣品重複計數3次，取平均值，再按公式計算每毫升菌液中所含的酵母菌數。

圖6-1 血球計數板的結構圖

（4）洗滌血球計數板。

使用完畢後，將血球計數板在水龍頭上用水柱衝洗，切勿用硬物洗刷，洗完後自行晾乾或用吹風機吹乾。鏡檢，觀察每小格內是否有殘留菌體或其他沉澱物。若不乾淨，則必須重複洗滌至乾淨為止。

思考題

1．結果：將結果記錄於下表中。A表示5個中方格中的總菌數；B表示菌液稀釋倍數。

25×16的計數板觀察計數記錄結果
16×25的計數板觀察計數記錄結果

2．為什麼用兩種不同規格的計數板測同一樣品時，其結果一樣？

3．在計數板計數操作過程中，說明血球計數板計數的誤差主要來自哪些方面？應如何儘量減少誤差，力求準確？

4．如何正確使用計數板計數？其操作步驟和工作原理是什麼？如何進行計算？

5．除計數板可以進行微生物細胞計數外，還有哪些方法可以進行細胞計數？

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