細胞計數及活力測定實驗方法及步驟詳解

一、細胞計數

 

1.  將血球計數板及蓋片用擦試乾淨，並將蓋片蓋在計數板上。

 

2.  將細胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計數板之間。

 

3.  靜置3分鐘。

 

4.  鏡下觀察，計算計數板四大格細胞總數，壓線細胞只計左側和上方的。然後按下式計算：

 

細胞數/ml=4大格細胞總數/ 4×10 000

 

注意：鏡下偶見由兩個以上細胞組成的細胞團，應按單個細胞計算，若細胞團佔10%以上，說明分散不好，需重新製備細胞懸液。

 

二、細胞活力

 

1.  將細胞懸液以0.5 ml加入試管中。

 

2.  加入0.5 ml 0.4%臺盼蘭染液，染色2-3分鐘。

 

3.  吸取少許懸液塗於載玻片上，加上蓋片。

 

4.  鏡下取幾個任意視野分別計死細胞和活細胞數，計細胞活力。

 

死細胞能被臺盼蘭染上色，鏡下可見深蘭色的細胞，活細胞不被染色，鏡下呈無色透明狀。

 

活力測定可以和細胞計數合起來進行，但要考慮到染液對原細胞懸液的加倍稀釋作用。

 

三、MTT法測細胞相對數和相對活力

 

活細胞中的琥珀酸脫氫酶可使MTT分解產生蘭色結晶狀甲贊顆粒積於細胞內和細胞周圍。其量與細胞數呈正比，也與細胞活力呈正比。

 

1.  細胞懸液以1 000 rpm離心10分鐘，棄上清液。

 

2.  沉澱加入0.5-1 ml MTT，吹打成懸液。

 

3.  37℃下保溫2小時。

 

4.  加入4-5 ml酸化異丙醇（定容）。打勻。

 

5.  1 000 rpm離心，取上清液酶標儀或分光光度計570 nm比色，酸化異丙醇調零點。

 

注意：MTT法只能測定細胞相對數和相對活力，不能測定細胞絕對數。

 

附：1、0.4%臺盼蘭染液配製：

 

臺盼蘭 0.4克 加雙蒸水至100 ml.

 

2、MTT配製：

 

MTT 0.5克，溶於100 ml的磷酸緩衝液或無酚紅的基礎液中。4℃下保存。

 

3、酸化異丙醇配製：

 

異丙醇中加入HCl使最終達0.04mol/L。