讓細胞計數更加準確的7個步驟 | 單細胞專題

2021-01-13 聯川生物

     


對於每種細胞計數方法，樣品表面必須是乾淨的。

任何汙染都可能導致不準確的結果。

對於人工細胞計數，這包括移除和清潔玻璃蓋片，然後用70%乙醇然後用水清潔計數腔。

當使用一次性塑料載玻片時，每個樣品都需要一個新的載玻片(如果載玻片有兩個分開的腔室，則需要一對樣品)。


在裝載樣品之前立即進行漩渦震蕩處理，是確保被分析樣品具有代表性的重要步驟。

不同大小和類型的細胞將以不同的速率沉降和聚集。在加載樣品之前立即旋轉溶液會增加等分的概率，並準確地反映細胞培養的特性。


細胞計數需要對整個細胞懸液中的少量樣本進行分析，因此必須注意確保樣品能夠代表原始整個單細胞懸液。聯川生物使用臺盼藍Countess法和螢光計數Countstar法以及最原始的血球計數板法等多種方法來對細胞活性進行監控和計算。

包括Countstar有採用螢光法，所以像是Countstar這樣的細胞計數器應用算法來識別活細胞或死細胞，但它們不能對不具代表性的樣本進行校正。

當手動計數時，與單個細胞相比，細胞成團率/結團率的評分更具主觀性，從而增加了可變性。細胞裂解後的細胞向外釋放的DNA（會造成粘稠結團））和細胞碎片是結團的常見原因。

細胞裂解可能是由於過度生長、過度移液的機械剪切或冷凍/解凍循環等因素造成的，而胰蛋白酶消化不足或過度也可能導致樣品的異質性。

目前為了降低細胞結團率，聯川生物通過溫和細胞裂解的方式來進行嘗試，以防止過為劇烈的酶解方式會導致細胞凋亡過快從而釋放更多的DNA。如胰酶等需要謹慎使用。

另外對細胞碎片的樣本進行過濾，甚至是過濾膜等方式，均可以減少細結團率。


無論是手動計數還是依靠Countess和Countstar等自帶軟體算法計數，調整焦距和曝光設置都很重要，以確保細胞儘可能有比較好的可見性/能見度，最終獲得最準確的細胞計數結果。

最佳的聚焦和曝光將在細胞膜和背景之間，有非常非常非常鮮明的對比。


如上圖所示，最佳的聚焦方面，左側屬於正確的聚焦。但是右側的圖為錯誤的聚焦方式，聚焦不充分。

上圖的螢光計數在曝光上，左側曝光度正常，中間屬於過度曝光，而右側為曝光不足

所以在使用螢光計數之前，條件允許下需要單獨優化每個螢光通道的能力，並將產生最具重複性的結果，來檢驗這種調整優化後螢光細胞計數儀的復現性和穩定性。

實驗室應該設置螢光強度，以確保細胞儘可能明亮，同時保持其真實大小-不應該有光從細胞的邊緣滲出。


血球計數板有多種型號規格可供選擇。不同型號的腔室高度和深度在設計上都差異巨大。實驗人員在計算細胞數量時要注意一些細節以避免錯誤。


大多數自動細胞計數儀都可以調整各種設置參數，以便與正在研究的細胞最佳匹配。

例如，可以設置和保存細胞大小範圍，以便將碎片或其他細胞群排除在分析之外。像Countstar等計數儀，可以用PBMC、Vero等細胞作為標準參考。


視野範圍內的亮度分析以有效地對培養的哺乳動物細胞進行計數。

然而，即便是使用臺盼藍都很難區分活細胞和死亡細胞，尤其是對許多原代細胞來說，需要使用螢光計數法。

例如，PBMC通常與大量的紅細胞混合在一起，通過一般的亮度分析，這些紅細胞可能會顯示為「死亡」。然而，使用吖啶橙(AO)和碘化丙啶(PI)等染料，可以只對有核的PBMC進行染色，並通過雙重螢光區分活細胞和死細胞。

AO和PI都可以對核酸進行染色，但只有AO能夠穿過活細胞膜。

最終活的PBMC被AO染色，並呈現螢光綠，死的PBMC同時被AO和PI染色，呈現螢光紅。但紅細胞沒有染色，根本沒有發出螢光。



卓林鋼，負責上海地區業務，2016年畢業於華東師範大學生物醫學研究所；

已經合作的客戶單位有上海交通大學醫學院，上海交通大學醫學院瑞金醫院，上海交通大學醫學院仁濟醫院，華東師範大學，上海市第一人民醫院，第二軍醫大學，上海長徵醫院，上海龍華醫院，復旦腫瘤醫院，上海計生所醫院等.......

 


從科研一線的工作者轉變為科研服務的高通量測序行業的一線銷售人員，多年的實驗經驗讓我能夠更好的和各位老師或是同學溝通，也更容易理解課題設計的關鍵點。經過了近半年的新冠疫情的考驗和沉澱，2020年下半年希望更好的服務於各位老師，希望自己在工作的過程中也全面提升。

在聯川，學習和體會到了很多東西

 


本身有多年疾病動物實驗的經驗，然後來聯川後近距離的了解學習各類組學，高通量測序方面的知識，結合自身生物學知識，時常可以給客戶一些小的建議或是探討一下課題的關鍵點，更好的推進課題進展。另外因為有多年的organoid培養的經驗，類器官也是很好的一個研究工具，如果有老師有意開展這方面工作的話，歡迎聯繫我交流。

 


入職聯川以來感受最深的就是同事間樂於相互幫助，充滿活力，對於每一個客戶項目都認真負責，部門間相互協作，精誠合作，很快能幫客戶給出方案，解決問題，給客戶最好的服務


總之來到聯川之後，我也學習成長了很多，相信在未來的時間裡，自己會進步成長的更快。在未來的日子裡，更加努力工作，做好服務，業績更近一步，也祝願各位老師的科研工作順利，做出更多更好的工作。



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