單細胞測序樣本操作原則和注意事項

2021-01-15 之發愛分享

1.1 樣本要求

（1）樣品總量：細胞懸浮液，歐易上門提取一個樣本細胞起始量大於 1×10 5 個；

（2）樣品濃度：5×10 5 - 1.2×10 6 / mL，最低需要 1×10 5 / mL；

（3）細胞活性：活細胞數在 90 %以上；

（4）細胞大小：小於 40 m；

（5）細胞培養基及緩衝液不能含有 Ca 2+ 和 Mg 2+ 等影響酶活性的物質；

（6）組織需解離成單細胞懸液，植物細胞需製成原生質體。

1.2 樣本準備原則

（1）建議使用寬槍頭重懸，以減少對細胞的損傷；

（2）每次移液前先混勻細胞懸液，然後從管中部吸取；

（3）所有環節都最好在無菌環節下操作、使用無核酸酶的試劑、減少移液步驟

以及當可能損傷細胞的時候儘量使用寬槍頭等。此外，可用一次性轉液管去除離

心後的上清液，以減少細胞沉澱的幹擾；

（4）取樣的時候最好設置兩個重複，對每個樣品計數 2 次，即共計 4 次計數；

（5）棄上清時候注意不要破壞細胞沉澱；

（6）某些細胞如 hPBMCs 在 PBS 中易成團狀，從而降低細胞有效濃度，因此制

備細胞懸液需迅速，最好在 30 分鐘內完成；

（7）最佳上樣體積為 2.5 L-15 L，建議上樣前根據實際需要上樣細胞數調整單

細胞懸液濃度；

（8）對於直徑較大的細胞如永生化細胞株建議室溫下 150 rcf 離心 3 min，對於

直徑較小的細胞如 PBMCs 建議室溫下 300 rcf 離心 5 min；

（9）重懸細胞濃度建議不要超過 5000 cells/ L，最理想的範圍保持在 700-1200

cells/ L，此濃度下計數較為準確；

（10）一般選用含 0.04% BSA（400g/ mL）的 1× PBS 溶液重懸細胞。但 PBS

並不適用於所有細胞，如原代細胞、幹細胞等敏感細胞類型可能需要另換緩衝液

以最大程度保證活性，已確定以下溶液對人 293T/17 和小鼠 NIH/3T3 細胞系的

10 ×單細胞操作無影響：

a. Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline（DPBS）；

b. Hank’s Balanced Salt Solution（HBSS）。

若在上述緩衝液中無法保證活性，可以選用細胞培養基洗滌細胞，以下培養基已

確定對人 293T/17 和小鼠 NIH/3T3 細胞系的 10×單細胞操作無影響：

Eagle’s Minimum Essential Medium（EMEM）+ 10% FBS；

Dulbecco’s Modified Eagle Medium（DMEM）+ 10% FBS；

Iscove’s Modified Eagle Medium（IMEM） + 10% FBS；

Roswell Park Memorial Institute（RPMI）+ 10% FBS；

Ham’s F12 + 10% FBS；

1:1 DMEM /F12 +10% FBS；

M199。

相關焦點

  • 單細胞RNA測序簡介
    這就是單細胞RNA測序的來源。在這個轉錄組和基因組測序的時代，我們有一些很好的技術來真正觀察發生了什麼。RNA測序是這些偉大的技術之一，通過將RNA轉化為cDNA，我們可以量化、發現和配置RNA。儘管RNA測序給我們帶來深刻的見解，但它並非沒有偏見，大多數RNA測序是在組織樣本或細胞群上進行的。細胞之間的生物差異可能被誤認為是技術性噪音，也可能被平均數據所掩蓋。
  • 利用參考樣本對單細胞 RNA 測序技術進行多中心研究
    12 月 21 日《Nature Biotechnology》發表了一篇文章，比較了不同技術和不同實驗室產生的不同單細胞 RNA 測序（scRNA-seq）數據集。研究人員使用兩個特徵良好的細胞參考樣本（乳腺癌細胞和 B 細胞），分別或混合採集，比較不同 scRNA 序列平臺和多個中心的預處理、標準化和批效應校正方法。雖然預處理和標準化有助於基因檢測和細胞分類的可變性，但批量效應校正是迄今為止正確分類細胞的最重要因素。此外，scRNA-seq 數據集的特性（例如，樣本和細胞異質性以及所使用的平臺）對於確定最佳的生物信息學方法至關重要。
  • 單細胞測序困難重重——細胞消化懸浮方案
    今天，我們就來聊一聊單細胞測序第一個「攔路虎」----單細胞消化與懸液製備，以及實驗過程中潛在的那些「坑」。④ 膠原酶消化，這一步注意事項較多。不過，像心臟和肝臟這樣的組織，本身紅細胞含量就超級高，裂紅在所難免。至於為什麼糾結，因為有些細胞類型被裂紅試劑處理後，會發生聚集並收縮在一團，用移液器輕微的吹打不容易將其分開，會影響後續實驗的單細胞得率。⑦ 最終，在檢測細胞活性/數量的時候，要麼走經典路線，光學顯微鏡+細胞計數板+臺盼藍；要麼走高科技路線，活/死細胞螢光染料染色後全自動計數儀操作。
  • 13種單細胞RNA擴增測序方法的比較
    前言 單細胞RNA測序（scRNA-seq）是繪製單個細胞分子特性的主要技術。目前高通量單細胞測序一次可以研究數千甚至上萬個細胞，從而使科研人員可以對樣本組成進行深入的研究。
  • 單細胞核測序時代是你的時代嗎
    很多老師想要研究某些特殊樣本，例如心肌細胞和神經元；也有很多老師手上有頗為珍貴的臨床凍存樣本，但是受限於單細胞測序對於樣本的嚴格要求——細胞數量要求大於105個、活細胞數在90%以上、細胞直徑小於40μm等，只能望「單」而嘆！
  • 高通量多通道的單細胞測序設備,將投入醫療科研應用
    近年來,單細胞測序和研究課題快速增長,數據顯示,2019年,Pubmed中已發表1338篇科學文獻,相較於2018年的661篇,同比增長102．4%。但單細胞測序試劑、耗材、技術服務等價格居高不下,以10x Genomics為例,一個單細胞組織樣本的數據產生服務費為2萬-4萬,數據分析較數據產生難度更高,服務費支出也更大。
  • 單細胞測序技術原理
    自此，單細胞測序技術被廣泛應用於基礎科研和臨床研究。單細胞在許多領域都佔有一席之地，對於癌症早期的診斷、追蹤以及個體化治療具有重要意義。 一.基本原理 單細胞測序首先不是僅僅對一個細胞進行測序，而是說該項技術能對單一細胞的基因組或轉錄組進行測序，可以理解為單細胞水平上的測序。 在介紹基本原理之前先讓我們嘗試著回答一下：為什麼要進行單細胞測序？
  • 單細胞數據上傳GEO操作指南
    最近很多老師的單細胞文章都紛紛開始投稿，卻被文章發表前的臨門一腳——GEO數據上傳難住了，今天我們就來一起學習下單細胞數據上傳GEO的具體操作步驟吧~跟著這份操作指南，上傳從此不再犯難！、晶片以及其他高通量測序數據。
  • 【盤點】單細胞測序研究進展一覽
    【3】單細胞測序助力中科院刊發《science》 表觀遺傳研究取得重大突破單細胞測序解決了用組織樣本測序或樣本稀少時無法解決的細胞異質性難題並行測序技術可以近日，一項發表於國際雜誌Science上的研究論文中，來自美國的研究者描述了一種新型的大規模並行技術，通過利用新一代測序技術來在單細胞水平上實現對基因表達的監測；研究者表示，單細胞分析對於理解人類造血系統的必要性及重要性不斷凸顯，如果沒有這種分析的話，來自少許細胞的大量表達改變就和來自許多細胞的小型表達改變就會變得一樣沒有差別。
  • 一篇文章終結你對單細胞核測序的所有困惑
    受限於樣本解離過程，單細胞RNA測序（single-cell RNA sequencing， scRNA-seq）目前存在三大問題scRNA-seq是應用最廣泛的單細胞測序技術第一，僅適用於新鮮組織樣本，對於凍存樣本，由於細胞已經喪失活性，因此無法開展scRNA-seq。這一點極大的限制了單細胞測序技術的應用範圍，同時也增加了操作的難度，降低了樣本通量。
  • 單細胞基因測序市場分析
    二、單細胞基因測序的基本流程：單細胞分離--基因組擴增--測序和分析　　單細胞測序，簡單地說，主要經過如下的步驟：單細胞的分離--DNA/RNA的提取和擴增(全基因組擴增和全轉錄組擴增)---測序以及後續的分析和應用。
  • 如何讓單細胞測序變得如此簡單?
    2017年7月20日 訊 /生物谷BIOON/ --單細胞生物學研究一直是當今的熱門話題，而且最前沿的領域就是單細胞RNA測序了（scRNA-seq）。當然了，這些發現都是來之不易的，相比大量細胞而言，研究人員很難對單個細胞進行操作，因為每一種細胞僅會產生少量的RNA，對於研究者而言沒有犯錯的餘地；另外一個問題就是如何對大量的數據進行分析，最重要的是，研究者使用的工具可能是並不直觀的。
  • 單細胞全基因組測序——求同存異,追本溯源
    2011年，《Nature Methods》將單細胞測序列為年度值得期待的技術之一；2013年，《Science》將單細胞測序列為年度最值得關注的六大領域榜首。近年來單細胞全基因測序不斷發展的技術方法和在各領域的研究成果也屢屢登上"NCS"的榮譽殿堂。仿佛一夜之間，單細胞全基因組檢測技術就成了生物醫藥研究人員的新寵。
  • 焦磷酸(甲基化驗證)測序注意事項
    根據最近的反饋，大家對焦磷酸測序的一些注意事項還不太了解，一個個解釋太累了，還是匯總一下，希望大家能認真的看。
  • 還在講精準醫療的你,不知道單細胞測序就OUT了!
    合併建庫，省去了對單個細胞的重複操作，大大提升了單細胞測序的通量和單個細胞測序的成本。該技術用20W+的微孔（該數量級遠大於Input細胞數量），基於泊松分布原理，將細胞懸液和帶有標記的磁珠添加至每個微孔中，並保證單孔中的單細胞捕獲。同時避免了10X中存在的概率碰撞影響捕獲效率的問題，採用微孔捕獲相對會有更好的捕獲效率，保證Input細胞的全面使用。對於Input細胞的量更少的情況，可以基於十萬級的細胞總量開始進行前期處理以及後期捕獲操作。
  • 單細胞數據挖掘與課題設計實戰課程
    單細胞測序技術並且在18年被Science雜誌評為「年度頭號科學技術突破」，被科學家認為是未來10年改變基礎生物學和醫學研究格局的技術。 下一個機會正在開放給有準備的人 但必須要考慮的兩個問題： 1.
  • 「單細胞測序」技術發展迅速,實現產業化還要多久?
    核心技術：單細胞測序與質譜流式細胞術單細胞測序主要有四個工作流程：單細胞製備、單細胞分離和文庫製備、測序和初級分析、生信分析。單細胞製備通常採用機械法、酶解法或其他組合方案將組織裂解，隨後將特定的細胞群富集、標記，成為單細胞樣本。單細胞分離與文庫製備是單細胞測序的關鍵步驟，與最終單細胞數據的質量、精準度息息相關。
  • 貝瑞基因攜手新格元打造多元化單細胞測序生態圈
    近日，貝瑞基因與新格元生物科技有限公司開展戰略合作，雙方將利用優質高效的自動化單細胞測序平臺，進一步拓展單細胞測序技術的應用場景，共同促進單細胞測序技術的發展，全力支持用戶在該領域開展多維度、深層次的前沿研究。
  • 《陳巍學基因》筆記⑩單細胞DNA測序
    而單細胞測序要求幾乎所有的原始基因組片段都得到有效擴增，「上述程度的浪費是難以接受的。」擴增效率以早期的 HiSeq 測序儀為例，大約每上機 2 萬個文庫分子，才會有 1 個文庫分子，能夠在測序的 Flowcell 表面生成簇，並且被測序測到。剩下的大多數文庫分子，在上機的時候是被水衝走的。所以，單細胞基因組擴增的方法，還要有較高的擴增效率。
  • 多種單細胞RNA測序平臺性能大比拼,七大平臺各有所長
    自2009年以來，單細胞RNA測序一直是推動生物醫學研究進步的重要動力。越來越多的單細胞RNA測序平臺被應用於科研和臨床。對於大規模的單細胞RNA測序研究來說，一個主要的技術障礙是高通量和靈敏度，還要考慮成本問題。