一篇文章終結你對單細胞核測序的所有困惑

單細胞測序（single-cell sequencing）是解析生物學現象最強有力的技術手段

自19世紀30年代細胞學說提出以來，「細胞是生命活動的基本單位」這一概念便成為生物學研究和發展的基石，近200年來的實驗不斷證明，我們只有了解細胞的特性與功能，才能深入理解生命現象的深層機制，才能明晰生物體生長發育的規律，才能辨明疾病發生發展的原因。

任何生物學過程都是通過複雜的細胞及分子的網絡相互作用來推進和完成的。任何組織正常的生理功能均依賴於適當的信號通訊及其相互作用。每個細胞均擁有其特定的功能，不同類型的細胞相互協調、發揮各自功能，從而組成各種生命體，因此，生命本質上是不同類型的細胞之間的相互作用網絡，且這一網絡處於時刻不停的動態變化之中。

生命的這種本質特徵，決定了生命現象背後都是動態的網絡相互作用，其複雜性超乎想像。按照傳統生物學方法去研究生命現象是無法解析其背後的運作機制的。只有通過高通量的組學技術，一次性對眾多的網絡變量（細胞）進行測量，我們才可能挖掘出生命現象背後的深層機制。因此，只有充分解析細胞網絡的特性和運作原理，我們才可能理解細胞作為生命活動的基本功能單位，是如何推動各種生命現象發生和發展的。

單細胞測序（single-cell sequencing）正是解析細胞網絡最強有力的技術手段。它通過繪製組織或器官的細胞圖譜，明確細胞的分子調控模式和狀態變化，為我們理解生命的細胞互作網絡提供了單細胞解析度的系統性洞見。近年來單細胞測序文獻的持續快速增長，以及Nature Methods雜誌2013年將單細胞測序技術評選為年度技術[1]，隨後又在2019年將單細胞多組學技術評選為年度技術[2]，這些情況充分證明了該技術對生命科學研究的重要性。

受限於樣本解離過程，單細胞RNA測序（single-cell RNA sequencing， scRNA-seq）目前存在三大問題

scRNA-seq是應用最廣泛的單細胞測序技術，目前已經走過了十個年頭，隨著在科研領域大量應用的展開，scRNA-seq逐漸顯示出一些固有的方法學問題，主要有三點。

第一，僅適用於新鮮組織樣本，對於凍存樣本，由於細胞已經喪失活性，因此無法開展scRNA-seq。這一點極大的限制了單細胞測序技術的應用範圍，同時也增加了操作的難度，降低了樣本通量。例如，許多臨床樣本為了保證RNA的穩定性，需要進行冷凍，而這樣的臨床存檔樣本（archived frozen samples）是無法進行scRNA-seq，直接導致很多具有重要科研和臨床價值的凍存樣本無法通過最新的技術進行研究。

第二，解離過程會誘導應激基因的表達，引起細胞轉錄模式發生「人為改變」（artifactual transcriptional stress responses），造成轉錄偏好（bias）。這樣獲得的數據無法真實的反應樣本的細胞轉錄狀態，結果的可靠性大大降低。

這一點已為眾多實驗所證實。Brink 等人就發現，37℃進行蛋白酶解離的過程會誘導應激基因的表達，引入人為誤差，造成細胞類型鑑定結果失準[3]。Adam等人也發現，37℃解離會造成細胞轉錄組的「人為改變（artifactual changes）」，導致結果不準確[4]。而最新的對比實驗進一步證實了這一現象：37℃解離誘導大量應激基因的表達量升高，會造成結果嚴重失真，而採用低溫解離步驟能夠有效避免這一現象[5]。

第三，對於很多實體組織，如腦、心臟、腎臟等，蛋白酶傾向於將易於解離的細胞類型解離下來，因此會丟失不易解離的細胞；同時一些較為敏感的細胞可能會因為解離過度而破碎。這樣，解離過程無法有效的獲取到組織中的所有細胞類型，結果的準確性大為降低。

例如腦部的齒狀回組織（dentate gyrus tissue）無法通過常規的解離手段獲得完好的細胞，因此這一組織中的細胞類型非常容易丟失[6]。腦部的新生神經元（newborn neurons）也會遭遇同樣的情況[7]。這一情況在腎臟組織的scRNA-seq中也同樣會出現[8]：腎小球足細胞（glomerular podocytes）, 腎小球繫膜細胞（mesangial cells）, 以及內皮細胞（endothelial cells）都無法通過scRNA-seq得到鑑別。對肺臟的scRNA-seq結果顯示，上皮細胞比例嚴重失真，而部分稀有細胞類型則無法得到鑑別[9]。目前商業化的單細胞平臺都對細胞大小有限制，都會使用細胞篩過濾掉不規則的、大的細胞，造成特定細胞類型的丟失，無疑將對數據的解讀和生物學機制的闡釋產生重要影響，結果的準確性無法得到保證。

講座福利插播

單細胞核RNA測序（single-nucleus RNA sequencing, snRNA-seq）為解決樣本解離引發的問題提供了完善的技術方案

使用細胞核進行單細胞測序（single-cell sequencing）的歷史由來已久，對基因組進行分析的文獻可以追溯到2011年，Navin等研究人員通過分離腫瘤組織細胞核，對單個細胞的CNV進行鑑定[10]，以此揭示腫瘤組織的細胞異質性。近年來關於通過細胞核進行單細胞基因組分析的文獻也多有報導[11,12,13]。而snRNA-seq則可以追溯到2013年[6]，作者針對腦組織難以解離獲得完整細胞的問題，通過細胞核RNA進行單細胞轉錄組分析。人類細胞圖譜計劃（HCA Project，Human Cell Atlas Project）主要負責人之一的Aviv Regev，其課題組在以往的腦組織scRNA-seq研究中發現稀有的神經細胞難以得到鑑定，因此開發了專門的snRNA-seq方案：Div-seq[7]，並在隨後進一步開發了DroNc-seq[14]，用以解決scRNA-seq難以獲取完整細胞類型的問題。在同一時期，加州大學張鵾教授課題組同樣通過細胞核對屍檢後的腦組織進行snRNA-seq，以擴展單細胞轉錄組分析的樣本類型，證明了來自臨床的凍存樣本完全可以進行單細胞轉錄組分析[15]。

在這些早期研究的引領下，snRNA-seq逐漸呈現出較為火熱的研究景象。特別是腦組織的單細胞轉錄組研究，目前多數文獻均傾向於使用snRNA-seq而不是scRNA-seq[16~27]。迄今為止，snRNA-seq已在多種組織類型中得以應用，包括肌肉組織[28]，心臟[29,30,31,32]，腎臟[5,8,33,34]，PBMC或培養細胞系[35,36,37]，血管[38]，肺臟[9]，胰臟[39]以及多種腫瘤組織[40]。這些文獻的結果一再表明，snRNA-seq相比scRNA-seq具有其明顯的優勢，將有力的促進我們更全面的理解組織的細胞發育和分化。

snRNA-seq能夠獲得更為可靠和準確的結果，更加充分了解組織的細胞異質性和細胞的分化、發育狀態

經過近年來的大量數據積累，已經可以確定snRNA-seq能夠解決scRNA-seq中存在的主要問題，具有以下幾點突出的優勢。

第一，樣本類型大大擴增，且操作步驟大為簡化而穩定。

細胞核膜相比細胞膜更為堅固，因此，凍存組織細胞膜破裂後細胞核則能夠保持完整。這也是snRNA-seq得以開展的基礎。正是基於這一基本特性，snRNA-seq才可應用於凍存組織的單細胞轉錄組研究，而近年來的研究結果也充分支持對凍存組織的snRNA-seq分析完全可以獲得高質量的數據和可靠的結果[5,14,15,40]。另外，由於僅涉及機械破碎和簡單的純化，snRNA-seq操作步驟相對簡化，便於開展實驗，其穩定性相比scRNA-seq大大提高。

第二，不會引入人為的轉錄偏好。

凍存組織中細胞的轉錄組是被「凍結」於採樣的時間點，細胞已基本喪失活性，不會再發生轉錄變化。因此，snRNA-seq不會出現轉錄偏好的情況，測序結果能夠真實反映採樣時間點的細胞轉錄模式，從而獲知最為準確的細胞轉錄狀態，這一點已經在眾多文獻中得到證明[5,6,8,9]。

第三，能夠鑑定到的細胞類型更為全面和完整。

由於採用機械法和化學試劑破碎細胞，snRNA-seq不會出現酶解方法的偏向性，所有細胞類型均能夠得到有效回收和鑑定，幫助研究人員獲取更加完整和全面的細胞圖譜。這一點在多種組織類型中均能獲得一致的結果[5,6,7,8,9,14,15,20,30,39,40]，說明snRNA-seq的技術方案是穩定而可靠的。

另外，由於缺失了細胞質中的RNA分子，snRNA-seq在鑑定細胞轉錄狀態中可能不如scRNA-seq，但根據目前的結果來看，snRNA-seq的表現與scRNA-seq完全一致，同樣能夠準確的捕捉到細胞的轉錄狀態，這一點已在不同組織、不同外界處理條件等多種情況下得到了證實。例如，Lacar等人通過snRNA-seq能夠揭示神經元的激活狀態[16]。Hu等人能夠解析皮質細胞的瞬時轉錄狀態[17]。在心臟疾病模型小鼠中，snRNA-seq能夠發現疾病特異性的細胞轉錄狀態[29]。而在心臟正常發育中，心肌細胞的發育軌跡也能得到很好的鑑別[31]。在心臟損傷研究中，細胞分化、發育的狀態同樣能夠清晰的予以顯示[32]。在腎臟疾病研究中，snRNA-seq展示了「一如既往」的穩定性，能夠揭示細胞的病理變化[34]。在胰臟的正常發育中，snRNA-seq同樣能夠揭示細胞發育和分化的動態變化[39]。

綜上所述， snRNA-seq解決了scRNA-seq中固有的一些問題，能夠獲得更為準確可靠的結果，因此相比scRNA-seq具有較為明顯的優勢。

snRNA-seq正在成為一種主流趨勢

近3年來，snRNA-seq文獻增長趨勢較為迅速，特別是國際主流實驗室在進行單細胞轉錄組測序時，均傾向於選擇snRNA-seq而非scRNA-seq，說明snRNA-seq正在逐漸變為一種「流行」。例如，Aviv Regev實驗室近幾年的單細胞測序文獻主要是通過細胞核進行的[7,14,22,40]，他們近期的工作也致力於證實snRNA-seq技術方案在腫瘤組織單細胞轉錄組測序中的有效性和可靠性[40]，為此還開發了專門用於snRNA-seq數據分析的生信流程：Cumulus[41]。加州大學張鵾教授課題組同樣主要通過snRNA-seq展開研究[15,34,42]，並開發了專門的多組學技術[42]。

另外，單細胞測序未來主要發展方向應當是提高細胞通量以及單細胞多組學技術。目前能夠實現百萬級細胞通量的技術方案均是通過細胞核進行測序的[43,44,45]，而單細胞多組學技術也是同樣如此[42,46]。

綜合以上發展情況，未來單細胞轉錄組研究有可能將是snRNA-seq佔據主要地位，而scRNA-seq由於本身固有的一些問題，將逐步讓位於snRNA-seq，僅僅局限在部分針對性的領域中，例如在神經小膠質細胞激活態（microglial activation）的研究中[27]。

基於10x Genomics的snRNA-seq是目前應用最為廣泛的技術方案

對近年來snRNA-seq文獻進行分析，能夠看到另外一個明顯的趨勢：基於10x Genomics平臺的snRNA-seq正在逐漸佔據主流。這一點在2020年已發表的snRNA-seq文獻中尤為明顯：今年發表的snRNA-seq文獻基本都是採用製備細胞核後通過10x Genomics平臺完成後續操作[5,9,27,30,32,36,37,39,40]。這應當是由於10x Genomics是目前最為穩定的商業化平臺，能夠保證較高的數據質量。在對不同平臺的snRNA-seq的系統性比較中，數據也證實了10x Genomics平臺的結果是最為穩定、可靠和準確的[36]。

寫在最後

細胞是生命活動的基本功能單位。單細胞測序是目前我們解析各種生命現象、揭示各種生物學機制的最強有力的技術手段。snRNA-seq技術以其穩定可靠的結果，將是未來單細胞測序發展的主流技術。隨著snRNA-seq數據的積累，我們將會越來越多的將表型、基因型與細胞核的轉錄模式聯繫起來，從而越來越清晰的理解生命的種種奧秘。也只有在洞悉這些機理的基礎上，結合各種工程學方法，未來我們才能夠攻克各種疾病，為人類健康與發展帶來福祉。

歐易生物snRNA-seq服務

歐易生物是國內最早開展單細胞測序分析的公司之一。目前擁有10x Genomics及BD Rhapsody兩個單細胞測序平臺，以及完整、系統的生物信息學分析技術和流程。

在科研前沿動態追蹤方面，歐易生物一直保持領先地位。了解到單細胞核測序的各方面優勢後，歐易生物便開展了相關研發工作，目前已經取得突破性進展。接下來，就給大家展示一下部分實測數據。

圖1 細胞核臺盼藍染色鏡檢

圖示製備好的細胞核經臺盼藍染色鏡檢，顯示細胞碎片等雜質＜10%，細胞核數量＞1000個/μL，細胞核總量>100,000個，滿足10x Genomics上機要求。

圖2 細胞類型鑑定

圖示小鼠心臟組織snRNA-seq，通過主要的心臟細胞marker能夠鑑定到所有類型的心臟細胞。

圖3 技術重複性鑑定

圖示小鼠心臟組織的snRNA-seq，兩個生物學重複之間顯示較好的重複性。

關於歐易

2009年，從基因晶片技術入手，本著為客戶提供優質而有溫度的高端技術服務這一簡單想法，歐易開啟了事業徵程。十餘年來，沐風櫛雨，初心不改，從基因晶片技術到文庫技術、二代測序技術、三代測序技術、質譜技術、單細胞測序技術，我們一直在高端組學技術領域開拓前行。通過技術研發、流程優化、精良設備引進、優秀人才聚集、持續管理提升，建立起了行業一流的質量標準以及嚴格的質量管控體系，並始終秉承「硬數據，好服務」的一貫追求，為客戶提供優質的高端技術服務。

歡迎有意向開展單細胞測序研究的老師們向我們諮詢溝通單細胞相關問題 （技術熱線：021-34781616）

參考文獻

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