Nat Biotech | 第6期導讀：納米孔測序、單細胞RNA計數技術等

撰文 | 十一月

責編 | 酶美

2020年6月刊，Nature Biotechnology共發表7篇文章，其中包括4篇Letters、1篇Articles和2篇Analysis，主要介紹了納米孔測序建立細菌完整基因組、單細胞RNA計數技術、微流控抗體篩選技術、利用gRNA篩選進行Cas13 gRNA優化設計以及組蛋白修飾可視化閱讀器的建立等。

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美國史丹福大學Ami S. Bhatt研究組發文題為Complete, closed bacterial genomes from microbiomes using nanopore sequencing，利用納米孔測序完成來自微生物群落的完整、封閉的細菌基因組。微生物基因組可以通過短讀測序數據進行組裝，但這些元基因組組裝的連貫性受到重複元素的限制。正確分配重複序列的基因組位置對於理解基因組結構對基因組功能的影響至關重要。作者們採用納米孔測序和名為Lathe的工作流程，結合長度組裝和短讀糾錯，從複雜的微生物群落中組裝封閉的細菌基因組。作者們使用該方法對12種細菌的基因組進行了組裝從而驗證了該工作流程的有效性。儘管與其他測序和裝配方法相比核苷酸的準確性下降，但是該方法提高了裝配的連續性，允許對微生物中重複元件的功能和適應性方面的作用進行研究。

原文連結：https://doi.org/10.1038/s41587-020-0422-6

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瑞典卡羅琳學院（Karolinska Institutet）Rickard Sandberg研究組發文題為Single-cell RNA counting at allele and isoform resolution using Smart-seq3，建立了Smart-seq3技術該技術可以在等位基因和基因亞型的解析度上對單細胞中RNA進行計數。對單個細胞的RNA進行大規模測序可以揭示不同細胞類型和狀態下的基因、亞型和等位基因表達模式。然而，目前的短讀（Short-read）單細胞RNA測序方法對等位基因RNA的計數和亞型解析度的能力有限，而長讀（Long-read）測序技術又缺乏在細胞中大規模應用所需的深度。在該工作中，作者們建立的Smart-seq3技術結合了全長度轉錄組覆蓋和5種獨特的分子標識RNA計數策略。在被計數和重構的分子中，60%可以直接分配到等位基因來源，30%-50%可以分配到特定的基因亞型，並且作者們發現在不同的小鼠菌株和人類細胞類型中基因亞型的使用有實質性的差異。與Smart-seq2相比，Smart-seq3極大地提高了敏感性，每個細胞可以多檢測數千個轉錄本。未來Smart-seq3技術可能將在組織和生物體中實現細胞類型和狀態的大規模表徵。

原文連結：https://doi.org/10.1038/s41587-020-0497-0

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法國HiFiBiO Therapeutics SAS的Colin Brenan 研究組、法國PSL研究大學Andrew D. Griffiths研究組、巴斯德所 Pierre Bruhns研究組合作發文題為High-throughput single-cell activity-based screening and sequencing of antibodies using droplet microfluidics，利用液滴微流控技術進行高通量單細胞活性為基礎的抗體篩選和抗體測序。挖掘漿細胞（Plasma cells）和漿母細胞（Plasmablasts）抗體庫可以發現用於治療或研究目的的有用抗體。作者們提出了一種高通量、單細胞篩選抗體的方法稱為CelliGO，該技術是一種液滴微流控系統，基於螢光的液滴對單細胞生物檢測，結合高通量篩選IgG活性並使用液滴單細胞條形碼逆轉錄對配對抗體V基因進行測序。作者們利用該平臺可以進行疫苗靶點、多功能酶或膜結合腫瘤靶點免疫小鼠的細胞中IgG序列多樣性、克隆擴增和體細胞超突變的分析。該技術對於進行高通過量的抗體篩選提供了重要平臺。

原文連結：https://doi.org/10.1038/s41587-020-0466-7

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美國紐約基因組中心Neville E. Sanjana研究組發文題為Massively parallel Cas13 screens reveal principles for guide RNA design，利用Cas13 gRNAs的大規模篩選建立gRNA優化設計的規則。VI型CRISPR酶是具有核酸酶活性的RNA靶向蛋白，能夠在不改變基因組的情況下特異性敲低靶標基因。為了對Cas13d gRNAs設計規則進行總結和定義，作者們對靶標mRNA和CD46、CD55以及CD71細胞表面蛋白進行了大規模並行篩選。總的來說，作者們在對24,460個gRNAs進行了活性測量後發現敲低效率由gRNA特異性特徵以及靶標序列位點環境所決定。

據此作者們開發了一個計算機模型對gRNAs進行優化鑑定以及確認其普遍性，同時利用對內源48個基因3,979 gRNAs進行測試以確定該模型的有效性。該模型可以對人類基因組中所有的蛋白質編碼序列進行預測和優化。值得一提的是，該工作為當期封面文章發表，利用大量篩選的數據開發建立了計算模型，用以優化Cas13 gRNA設計。

原文連結：https://doi.org/10.1038/s41587-020-0456-9

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瑞士蘇黎世大學Tuncay Baubec研究組發文題為ChromID identifies the protein interactome at chromatin marks，建立在小鼠胚胎幹細胞中穩定表達的染色質表觀遺傳修飾閱讀器用以監測不同的染色質修飾。染色質修飾通過招募蛋白質進入基因組來調節基因組功能。然而，在不同的染色質修飾的蛋白質組成還沒有完全的表徵。在該研究中，作者們利用天然蛋白結構與模塊化構建工具，開發了選擇性的用於H3K4、H3K9和H3K27甲基化以及DNA甲基化的染色質閱讀器 (Engineered chromatin readers, eCRs)。通過在小鼠胚胎幹細胞中穩定表達eCRs並測量其亞核定位、基因組分布和組織分化結合偏好，作者們首次證明了其在活細胞中作為選擇性染色質結合物的作用。通過將eCRs與生物素連接酶融合，作者們建立了ChromID技術，該技術是一種基於近距離識別生物素化蛋白相互作用的方法並可以將其應用於小鼠幹細胞中不同的染色質修飾的檢測。利用合成的雙修飾閱讀器，作者們揭示了以H3K4me3和H3K27me3為標記的雙價修飾啟動子的蛋白組成。該文章為染色質組蛋白修飾以及DNA修飾的研究提供了重要的可視化和高通連測序工具。

原文連結：https://doi.org/10.1038/s41587-020-0434-2

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美國Broad研究所Joshua Z. Levin研究組發文題為Systematic comparison of single-cell and single-nucleus RNA-sequencing methods，對單細胞和單細胞核RNA測序的方法進行系統性比較。近年來，單細胞RNA測序方法的規模和能力迅速擴大，使重大發現和大規模細胞繪圖工作成為可能。然而，這些方法還沒有系統和全面的標準。在該研究中，作者們對7種單細胞或者單細胞核測序建立圖譜的方法進行對比。作者們利用這些方法分別測試了細胞系、外周血單核細胞以及腦組織這三種類型的樣本，在6個獨立實驗中共產生了36個文庫。為了直接比較這些方法，作者們開發了一個計算模型稱為scumi，該計算模型可以用於任何單細胞RNA測序方法，系統性的對這些單細胞RNA測序方法進行了比較並對優缺點進行了總結。

原文連結：https://doi.org/10.1038/s41587-020-0465-8

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西班牙巴塞隆納科學與技術學院Holger Heyn研究組發文題為Benchmarking single-cell RNA-sequencing protocols for cell atlas projects，對不同的單細胞測序技術進行了系統性評估。scRNA-seq是表徵樣本中單個細胞轉錄組的技術。目前最新的scRNA-seq實驗方法可以擴展到數千個細胞，並被用於建立組織、器官和有機體的細胞圖譜。然而，這些實驗方法在RNA捕獲效率、偏好、規模和成本方面存在很大差異，而且它們在不同應用中的相對優勢尚不清楚。因此，作者們通過現有的13種常用的scRNA-seq實驗方法生成基本數據圖譜來系統地評估這些實驗方法在全面描述細胞類型和狀態方面的能力。該工作通過不同的方案在文庫的複雜性和檢測細胞類型標記的能力上有所不同，對它們的使用價值和細胞圖譜的適用性進行評估，為研究人員選擇性使用不同的scRNA-seq實驗方法提供了指導。

原文連結：https://doi.org/10.1038/s41587-020-0469-4