單細胞RNA測序技術的研究進展

摘　要 細胞是生物的基本組成部分，每個細胞都是唯一的。單細胞RNA測序已成為解剖細胞異質性並將組織分解成細胞類型和/或細胞狀態的必不可少的工具，這為從頭發現提供了巨大的潛力。單細胞轉錄組圖譜提供了前所未有的解析度，可揭示複雜的細胞事件並加深我們對生物系統的了解。在本綜述中，簡要簡紹了單細胞RNA測序技術及相關應用。我們預計單細胞RNA測序在生物學中的作用將日益增強，在提供空間信息和與細胞形態的方面將進一步提高。將來，能夠更好地應用於科研領域。

ABSTRACT Cells are the basic components of organisms, and each cell is unique.Single-cell RNA sequencing has become an indispensable tool for dissecting cell heterogeneity and breaking down tissue into cell types and/or cell states,which provides great potential for de novo discovery.The single-cell transcriptome map provides unprecedented resolution,reveals complex cellular events and deepens our understanding ofbiological systems.In this review,a brief overview of single-cell RNA sequencing technology and related applications.We anticipate that the role of single-cell RNA sequencing in biology will be increasingly enhanced, and that it will further improve spatial information and cell morphology.In the future,it can be better applied in the field of scientific research.

關鍵詞　單細胞RNA測序 細胞 應用 測序技術

Key words：scRNA-seq   Cell  Application  Sequencing technology

從Sanger測序開始，我們第一次可以閱讀我們的遺傳密碼。然而，該方法昂貴且勞動強度大。因此，花了13年時間和30億美元完成了「人類基因組計劃」。在下一代測序（NGS）方法之前，單個研究項目的測序在經濟上並不可行（微陣列是方法的選擇）。NGS可以實現高通量合成測序（SBS），降低成本並提高可行性。最近上市的第三代測序儀Nanopore器件將進一步推動這一極限。2009年研發了第一種單細胞RNA測序方法（scRNA-seq）1。單個細胞是生物的基本組成部分，每個細胞都是獨特的。進行大量RNA測序通常掩蓋了這種獨特性，並且無法揭示潛在的變化。scRNA-seq已經成為目前研究細胞的重要工具，用於揭示每個細胞的獨特性，從而以微觀解析度研究生物學並解決以前無法回答的問題2。在過去的幾年中，scRNA-seq已被用於揭示以前未認識到的細胞異質性水
平3-5，揭示基因之間的調控關係6、7，並跟蹤發育中不同細胞譜系的軌跡8。在這篇綜述中，我們總結了單細胞轉錄組學及其生物學應用方面的最新技術發展。

scRNA-seq是一種在單細胞水平上分析細胞特異性轉錄組的強大方法。通常，scRNA-seq方法由四個步驟組成：（1）單細胞分離，（2）反轉錄，（3）cDNA擴增（4）測序文庫的製備。前三個步驟通常在單管反應中完成，以最大程度地減少材料損失。此時，最後一步通常使用基於轉座酶Tn5的片段進行文庫製備（如果cDNA尚不是短片段），然後在Illumina平臺中測序。接下來，我們將詳細介紹scRNA-seq程序的前三個步驟。從細胞群體中分離出研究所需的單細胞，有多種的方法可供選擇。可根據通量的要求，以及是盲選還是有偏向的選擇，這些要求選擇單細胞分離的方法。

值得注意的是，如果採用酶處理，由於酶消化不足，酶解處理中的時間長於物理分解更可取。一旦獲得單細胞懸浮液，就可以使用多種方法將每個細胞遞送到各個反應管中。微量移液（手動或自動）通常用於從幾乎沒有可用細胞的樣品中捕獲細胞。儘管這種方法既費時又產量低，但在顯微鏡下目視確認以確保只選擇高質量的單個細胞是一個優勢。其中電生理後可以收集基因的胞質溶膠。

當試驗樣品有大量細胞可用時，採取螢光激活細胞分選（FACS）和微流控設備的方法對單細胞進行分離是非常不錯的手段。兩種方法都可以實現高吞吐量。基於報告基因的表達或針對表面蛋白或細胞內標記物的抗體染色，FACS也可用於富集某些細胞類型。但是，應考慮偶爾包含一個以上的細胞（雙峰）以及由於分選壓力對細胞造成的潛在損害。在其中將細胞捕獲在反應室或液滴中，然後進行高度標準化和自動化的納升反應的微流體裝置，對細胞而言更為溫和，而且具有成本效益。缺點是假定的細胞丟失和某些細胞大小的偏差。為了克服細胞大小選擇問題，微孔平臺可以替代。通過將細胞懸液分配到微孔板中，尺寸沒有偏差，可以進行顯微鏡觀察以排除雙峰。

RNA的捕獲和cDNA的合成始於反轉錄。大多數已發表的方案使用OligodT引物，它選擇了聚腺苷酸化的mRNA和一些lncRNA。這種方法避免了核糖體RNA（rRNA）的捕獲,rRNA佔哺乳動物細胞中總RNA的95％以上。但是，通過OligodT引發不可避免地會排除非聚腺苷酸化的RNA，其中包括大多數非編碼RNA和環狀RNA。SUPeR-seq已開發出來，可對單個細胞中的聚腺苷酸化和非聚腺苷酸化的RNA進行測序，而對rRNA和基因組DNA的汙染卻最小9。此方法使用具有固定錨序列（AnchorX-T15N6）的隨機引物。這些引物包含六個隨機核苷酸和OligodT，用於與聚腺苷酸化和非聚腺苷酸化的序列退火。出乎意料的是，沒有任何rRNA的掩蔽/消耗步驟，rRNA並沒有明顯的擴增，只有1.5％的總測序讀數映射到rRNA（Rn5s，Rn5.8s，Rn18s和Rn28s）。據推測，有限的RNA材料，特異性裂解和RT程序不足以打開rRNA的二級結構，因此導致rRNA的RT效率低10。不幸的是，除了Tang 2009，該方法尚未與其他流行方法進行廣泛比較。最近，據報導MATQ-seq比Smart-seq2更加靈敏和定量11。 MATQ-seq提供整個基因體覆蓋範圍，並允許檢測總RNA，這是一個重大進步。此改進基於使用MALBAC（基於多個退火和基於環的擴增循環）引物。這些MALBAC引物包含27個共同序列，後跟5個隨機核苷酸，它們僅在3'端不同，分別為T20或G3 / A3 / T3，大大提高了反轉錄效率，並隨後產生了PCR擴增子。

將RNA轉換為第一鏈cDNA後，可以使用不同的策略實現第二鏈合成。一種方法是SMART技術（RNA模板50末端的轉換機制），利用M-MLV轉錄酶（Moloney Murine白血病病毒逆轉錄酶）的轉移酶和鏈轉換活性，將模板轉換寡核苷酸作為下遊PCR擴增的銜接子12。此類方法包括Smart-seq，Smart-seq2和STRT。另一種方法是將cDNA的5'末端與poly（A）或poly（C）連接，以構建用於PCR擴增的通用接頭。PCR是一種非常常見的方法，可以從微量的輸入物質中生成足夠的cDNA。但是，指數擴增可能會使基因表達圖譜的表達偏向較短和較少的富含G-C的擴增子。

為了避免這種情況，開發了CEL-seq，這是第一種使用體外轉錄（IVT）作為獲得線性擴增的替代方法13。通過將T7啟動子摻入poly（T）引物中，在第二條鏈合成後進行IVT。互補RNA可以片段化並與3'銜接子（CEL-seq，MARS-seq）連接，或者通過隨機引物進行另一輪逆轉錄以提高靈敏度（CEL-seq2）。IVT消除了模板切換步驟的要求。

此外，MALBAC-RNA方法基於多重退火和基於環的擴增循環（MALBAC），該擴增循環是為單個細胞的全基因組擴增而開發的14。該方法使用準線性而不是指數擴增來擴增和測序單個細胞的轉錄組。 MALBAC引物產生具有互補末端的擴增子，這些末端環化並防止DNA呈指數複製，從而避免了擴增偏差。

scRNA-seq的方法可分為13種CEL-Seq2、MARS-Seq、Quartz-Seq2、gmcSCRB-Seq、Smart-Seq2、ddSEQ、ICELL8、C1HT-Small、C1HT-Medium、Chromium、Chromium(sn)、Drop-seq以及inDrop。西班牙國家基因組分析中心（CNAG-CRG）領導的國際研究團隊他們對這常用的13種單細胞RNA測序方法進行多面的性能評估，以此作為參考可以讓人們在以後的實驗中能夠選擇最適合的方法15。在這篇文章中，系統地評估了不同測序方法對RNA的識別能力，以及描述組織複雜性和構建細胞圖譜適用性的能力。使用同一參考樣品，對目前具有代表性的13種測序方案進行全面的分析。此次研究所用的細胞需要滿足四個條件：包含多種細胞類型；某些細胞基因表達只有細微的差異；細胞具有可追蹤的標誌物；包含不同物種的細胞。參考樣品組成：外周血細胞（60％，人），結腸細胞（30％，小鼠），HEK293T細胞（6％，紅色螢光蛋白標記的人細胞系），NIH3T3 細胞（3％，綠色螢光蛋白標記的小鼠細胞）和MDCK細胞（1％，TurboFP650標記的狗細胞）。研究人員根據檢測細胞圖譜和標誌物表達的精確度來評估這些方法的各方面性能。通過對30,807個人源細胞和19,749個鼠源細胞進行分析，產生了參考的數據集。並從基因檢測、轉錄特徵表達的總體水平、細胞簇的準確性、分類概率、數據整合後的細胞簇準確性以及可混合性這六個方面考察了不同的單細胞RNA測序方法繪製細胞圖譜的能力。最終匯總的數據如下圖。通過這些研究發現Quartz-Seq2方法在眾多方案中最為準確，在基準測試中得分最高，緊隨其後的是CEL-Seq2和Chromium。

scRNA-seq的應用方向是非常廣泛的，如人類細胞圖譜構建、細胞發育以及分化研究、細胞異質性研究、免疫方向研究、疾病分型。可以說，幾乎所有涉及細胞的領域都可以應用單細胞測序，單細胞測序已經成為神經系統、發育、免疫研究、腫瘤等研究領域的強大的研究助力。接下來簡要介紹細胞發育以及分化研究和細胞異質性研究中scRNA-seq起到的作用。這兩方面的研究也是目前單細胞測序技術運用最為廣泛的兩個方面。

單細胞測序可以通過剖析細胞異質性，鑑定不同細胞表型，進一步結合擬時間曲線等手段探索細胞發育和分化路徑，在解析幹細胞發育和分化機理等過程中發揮重要作用。

人類早期胚胎中的細胞數目非常少而且很難獲得，單細胞技術使這些樣本的轉錄組分析成為可能，同時更有助於深入理解細胞分化、重編程及轉分化等過程及相關的基因調節網絡。

在相關的實驗研究中使用單核RNA測序分析法繪製成年人前額葉皮層中人特異性的表達圖，並確定成年後持續存在的發育差異以及僅在成年大腦中發生的細胞狀態特異性變化。數據提供了大猿前腦發育的顳細胞圖譜，可闡明了人類獨有的動態基因調控功能16。

腫瘤是疾病狀態下的、具有高度異質化的組織，腫瘤基因組的存在高度多樣性及動態變化。scRNA-seq將幫助我們對隱藏於的罕見細胞類型及突變進行檢測，它們可能會最終導致耐藥的發生，從而從根本上避免給患者服用無效、甚至有毒性的藥物進行治療。

神經組織是類高度複雜的組織，神經元表達的基因多於其它類型的細胞，導致了神經元具有很高的異質性。單細胞測序技術將有助於我們確定神經元、膠質細胞和血管細胞的特定標誌物，並將其與其他信息相關聯，從而闡明人類大腦的細胞複雜性。

隨著單細胞轉錄組測序技術的不斷發展，相應技術的逐漸完善，必將成為科研工作者們探索生命科學的一項重要技術。　

由於單個細胞中RNA物質的稀缺以及隨機轉錄的性質，scRNA-seq數據經常面臨高細胞間變異性的挑戰（即零表達主要在具有100e1000讀計數的低表達基因中膨脹）。這種可變性是由技術噪聲（例如RNA捕獲效率，文庫製備期間的隨機缺失）和生物噪聲（例如隨機基因表達，各種細胞狀態，細胞大小和細胞周期狀態）引起的2。此外，在高通量數據中經常發現實驗性批次效應作為系統誤差17。可以在樣品處理步驟中引入批次效應，即在不同的測序深度分別捕獲細胞並進行測序，使用不同批次的試劑，並涉及多個生物樣本。仔細計劃每個實驗步驟並使用多個生物複製品可以最大程度地減少批次效應。

然而，由於可變的捕獲效率和生物學標本的遺傳背景，跨細胞的可變基因檢測率很難通過實驗程序來控制。識別是否存在批次效應的一種方法是使用主成分分析（PCA）可視化數據，並觀察細胞是否按其實驗來源分組。

再者單細胞RNA測序（scRNA-seq）提供了單個細胞的詳細信息；但是，關鍵的空間信息通常會丟失。目前提出了SpaOTsc，這是一種依靠結構化最佳運輸來通過利用相對少量基因的空間測量來恢復scRNA-seq數據的空間特性的方法18。

因此，最小化RNA損失並保持信息保真度是scRNA-seq技術中的關鍵挑戰。應謹慎解釋scRNA-seq結果，通常建議進行功能驗證。

目前測序技術在不斷發展，scRNA-seq技術也得到了廣泛的關注。近年來，scRNA-seq技術取得了較為突出的發展，也展現出了它獨特的優勢，在諸多領域發揮著關鍵作用，相信之後隨著科學技術的不斷發展，scRNAseq技術將會更廣泛的應用於我們的研究生活中。就目前scRNA-seq 技術的發展狀況而言它仍處於需不斷開發的的時期，在目前多組學蓬勃發展的前提下，未來的scRNA-seq 技術將會與更多的方法與之相結合，為全面觀察單個細胞提供基礎，期待未來的人們能揭開單細胞的神秘面紗。

umasi-Boateng K, Pet

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來源：劉雅靜｜圖文

老師：陳德富

編輯：李玉   李錦珊

本公號長期徵收稿件
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指導教師：陳德富

南開大學生命科學學院教授、博士生導師

首屆「談家楨遺傳教育獎」獲得者（2013）

南開大學遺傳學和細胞生物學系主任

南開大學分子遺傳學實驗室PI

南開大學本科生《遺傳學》和《普通生物學》課程負責人

南開大學研究生《現代細胞工程技術》和《分子生物學實驗》課程負責人

天津市科學技術協會委員

天津市生命科學學會聯合體主席團成員、學術諮詢顧問委員會委員

中國遺傳學會常務理事、教學與教育委員會副主任委員、科普專業委員會委員

天津市遺傳學會理事長、支部書記

《遺傳》雜誌優秀編委（2016）

主辦單位：陳德富實驗室
承辦單位：2020生物與醫藥班