方法升級 牛津納米孔公司開發Direct RNA測序方法

2021-01-19 測序中國

牛津納米孔技術公司（Oxford Nanopore Technologies）的研究人員開發出了一種在MioIon納米孔測序儀上進行Direct RNA測序（direct RNA sequencing）的方法，近期發表在預印本網站bioRxiv上。

Oxford Nanopore公司應用程式高級主管、文章通訊作者DanielTurner說，公司計劃今年發布該方法的早期開發工具包，並邀請感興趣的客戶就他們希望看到的應用方向給予反饋。

RNA測序一般包含合成互補DNA鏈和利用PCR建庫的步驟。但是建庫中PCR會引入偏好性，例如產生PCR重複（PCR duplicates），難以與真正的RNA序列區分開，並且還會引起表觀遺傳信息丟失。

Oxford Nanopore公司對DNA測序方法的建庫步驟進行了一些改動，以用於Direct RNA測序中。由於RNA是單鏈而非雙鏈，DNA測序建庫中基於轉座酶和加接頭的方法不適用，因此研究人員採用了一種基於連接的方法。


研究人員首先從帶有polyA尾的RNA開始，將RNA接頭（一種逆轉錄酶夾板序列）連接到polyA尾上。由於RNA是單鏈，研究人員僅對RNA進行1D測序。另一個主要的區別是，RNA以相反方向來測序。

建庫中，將RT夾板接頭連接到RNA的polyA尾後，研究者進行逆轉錄產生cDNA分子，然後將測序接頭和動力蛋白連接到mRNA/cDNA複合體上。雖然建庫中生成了cDNA，但是並不對其進行測序。

Turner解釋，省略cDNA步驟而進行Direct RNA測序是可行的，但是研究人員發現，儘管並不對合成cDNA測序，但合成cDNA提升了測序性能。cDNA可能通過降低RNA的分子內二級結構，幫助提升了通量。Turner表示，公司在努力開發一種方法，可以不進行cDNA合成步驟，同時保持高性能，採用的措施包括：使用更潔淨的接頭，去除未連接上接頭的RNA，使動力蛋白運行的更快。

當測序接頭連接到mRNA/cDNA複合體後，mRNA被測序。由於初始接頭是連接在polyA尾上，RNA分子被反向測序（從3』到5』）。Turner表示，公司將繼續研究從5』端測序的可能性。反向測序的一個優點是，研究小組可以設計接頭連接到已知的polyA序列上。

Turner說，納米孔中RNA引起的電流水平與DNA引起的電流水平略微不同，因此公司需要訓練鹼基識別工具，來識別這些不同電流水平。另外，由於測序是反向進行的，研究人員還需要調換這些序列的順序。對於鹼基識別，研究人員使用了隱馬爾可夫模型，但是Turner表示，公司計劃將這種模型替換成一種遞歸神經網絡方法。

研究人員在人類鼻病毒樣本中證明了該方法，從7.5kb的單鏈RNA基因組中製備了1D RNA模板。此外，他們還表明，Direct RNA測序可以檢測鹼基修飾。他們對已知m6A鹼基修飾的轉錄本和沒有任何修飾的轉錄本進行測序，結果表明Direct RNA測序可以區分出完全修飾和完全未修飾的轉錄本。

Turner表示，公司將繼續改進該方法。例如，研究人員正在篩選不同的動力蛋白，希望找到那些可以平穩運動、持續合成能力高以及處理速度快的蛋白。另外，研究人員正在測試納米孔中的不同突變，希望獲得良好分離的電流水平。理想情況下，公司將利用相同的小孔進行DNA和RNA測序。Turner說，「如果結果表明最適宜進行RNA測序的小孔與最適宜進行DNA測序的小孔不同，那麼我們將為用戶提供兩種納米孔。」

在MinIon測序儀上進行的Direct RNA測序最初將主要用於尋找剪接變異。接下來在更高通量的PromethIon測序儀上進行的Direct RNA測序可以產生表達譜。其他應用還包括，對宏基因組樣本進行16S rRNA分析，以從混合樣本中鑑定物種。Turner說，「16S rRNAs非常豐富，而且RNA製備很快，因此這種方法將成為一種快速鑑定宏基因組物種的方法。」

Helicos BioSciences公司在2009年開發出一種Direct RNA測序方法，該方法不依賴於將RNA轉換成cDNA，SeqLL公司目前將這種方法作為一種服務提供給用戶。然而這種方法讀長非常短，約為20~50bp。Turner認為，Helicos將他們的方法當做是Direct RNA測序方法，是有爭議的，因為這種方法是邊合成邊測序，並且讀取的是添加到RNA模板上的DNA鹼基，而不是RNA模板本身。

另外，PacBio公司此前曾表示正在開發一種Direct RNA測序方法。PacBio目前的Iso-Seq方法依賴於PCR，但有能力產生非常長的reads，可用於新異構體的識別和全長轉錄本的測序。

Oxford Nanopore公司開發的在MinIon測序儀以及PromethION測序儀上進行的Direct RNA測序方法在其他方法之上，因為它既具有長讀長的優勢，還是一種無需PCR的方法。

參考文獻：Highly parallel direct RNA sequencing on an array of nanopores. doi:http://dx.doi.org/10.1101/068809

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