基於納米孔測序開發同步檢測CpG甲基化和染色質可及性的新方法

在DNA水平探索表觀遺傳學可以增進我們對不同階段表觀基因組的了解。其中，獲取甲基化和染色質可及性等動態變化信息對於分析表觀特徵有著重要意義。納米孔測序（Nanopore sequencing）是一種新興的單分子測序技術。利用納米孔測序進行快速、準確、高精度及高通量的DNA測序是後基因測序時代的熱點之一。已有研究表明，納米孔測序可準確檢測內源性CpG甲基化，也能夠對染色質可及性位點進行外源標記。那麼納米孔測序能否同時檢測這兩種信息呢？

為實現這一目標，美國約翰霍普金斯大學研究團隊基於納米孔測序技術開發了一種能夠同時檢測CpG甲基化和染色質可及性的測序方法——nanoNOMe-seq。該方法可利用GpC甲基轉移酶外源性標記開放染色質，並通過納米孔測序檢測長鏈DNA上的CpG甲基化和染色質可及性狀態。通過對四種人類細胞系進行分析，研究團隊構建了包括CpG甲基化和染色質可及性等信息的人類表觀基因組圖譜，並揭示了乳腺癌細胞和非癌細胞之間的甲基化和染色質可及性差異。相關研究成果已發表在Nature Methods上。

文章發表於Nature Methods期刊

該研究使用的NOMe-seq技術是Active Motif公司於2012年開發的一種新測序技術。該技術可利用外源性GpC甲基轉移酶標記基因組可及性區域，結合亞硫酸氫鹽轉化，在全基因組範圍內，檢測同一個DNA分子中的甲基化小狀態和核小體定位信息。基於該技術，研究團隊首先對已有的nanopolish軟體進行優化，使其能夠同時準確檢測CpG甲基化和GpC甲基化。然後應用GpC甲基轉移酶外源性標記開放染色質，利用納米孔技術對細胞進行NOMe-seq測序，即nanoNOMe-seq分析。

結果顯示，nanoNOMe-seq檢出的CpG甲基化與WGBS結果高度一致。通過分析GpC甲基化頻率得出的染色質可及性數據與ATAC-seq、DNase-seq結果基本一致。

圖：nanoNOMe-seq概述與評估，來源：Nature Methods

隨後，研究團隊利用同一DNA分子鄰近GpC基序信息估計了特定位點的染色質可及性。通過評估單個reads上的多功能轉錄因子（CTCF）結合位點的可及性和甲基化，結果顯示，該方法可以降低測序誤差，並保留對核小體的追蹤。同時，研究發現，在高表達基因的轉錄起始位點（TSS）附近核小體定位有序，染色質開放水平更高，並且利用nanoNOMe-seq還可獲得與活性啟動子狀態相關的蛋白結合信息。

利用nanoNOMe-seq方法，研究團隊構建了人類細胞基因組DNA甲基化和染色質可及性的全基因組等位基因特異性圖譜，分析比較了常染色體基因、X染色體失活基因和逃逸基因在TSS附近的甲基化和染色質可及性。研究發現，在父系和母系等位基因的甲基化和染色質可及性存在顯著差異的區域，兩者重疊區域（6%）表現出甲基化增加，染色質可及性降低的高度一致性趨勢。此外，多數結構差異在等位基因間的甲基化水平上無顯著差異，缺失突變的基因表現出低甲基化，插入突變的基因則表現出高甲基化。

研究團隊將該方法進一步應用於乳腺癌模型，經表觀遺傳分析發現，乳腺癌細胞系（MCF-7，MDA-MB-231）主要表現為低甲基化；乳腺上皮細胞MCF-10A的染色質可及性區域多於兩種乳腺癌細胞。並在兩種乳腺癌細胞中發現1個特異性基因插入突變，其下遊區域表現出高甲基化和染色質不可及性，表明該乳腺癌細胞基因組變異與表觀遺傳狀態相關聯。

在這項發表在Nature Methods的最新研究中，研究團隊利用新建立的nanoNOMe-seq技術，實現了CpG甲基化狀態和染色質可及性的同步檢測，並確定了單個分子上的組合啟動子表觀遺傳學特徵。納米孔長讀長測序使將reads穩固地分配給單倍型成為可能，從而使我們能夠在單分子水平生成完全定相的人類表觀基因組，用於表徵複雜的表觀遺傳信息，為深入了解表觀基因組的複雜性提供新的視角。

參考文獻：

Lee, I., Razaghi, R., Gilpatrick, T. et al. Simultaneous profiling of chromatin accessibility and methylation on human cell lines with nanopore sequencing. Nat Methods (2020). https://doi.org/10.1038/s41592-020-01000-7