多種單細胞RNA測序平臺性能大比拼,七大平臺各有所長

　　自2009年以來，單細胞RNA測序一直是推動生物醫學研究進步的重要動力。越來越多的單細胞RNA測序平臺被應用於科研和臨床。對於大規模的單細胞RNA測序研究來說，一個主要的技術障礙是高通量和靈敏度，還要考慮成本問題。隨著低成本、高通量的液滴單細胞RNA測序平臺的推出，研究人員在單細胞研究中有了更多的選擇，但現有的平臺性能如何?科研人員又該如何選擇?

　　為幫助研究人員根據自身需求選擇最適合單細胞RNA測序平臺。部分國內外科學家對已有平臺進行了系統的性能比較，今年4月，生物分子資源設施協會(ABRF)公布了四種單細胞RNA測序平臺Fluidigm、WaferGen、10X Chromium Controlle和Illumina/Bio-Rad測序平臺的性能差異。11月，中國北京大學黃巖誼研究組、清華大學王建斌研究組等研究人員，聯合發表了三種基於液滴的單細胞RNA測序平臺10X Genomics Chromium、inDrop和Drop-seq的性能比較結果。兩項獨立研究結果均顯示，沒有一種平臺可以很好的滿足用戶的所有需求，各個平臺均有優缺點以及各自的應用範圍。

研究一：10X Genomics Chromium、inDrop、Drop-seq性能比較

　　

黃巖誼（左） 王建斌（右）

黃巖誼、王建斌的聯合研究成果已發表在Molecular Cell。研究人員利用同一個淋巴母細胞系，對常用的三種基於液滴的超高通量單細胞RNA測序平臺10X Genomics Chromium和inDrop、Drop-seq進行了性能比較，每種平臺進行2~3個重複檢測。同時，他們還開發了可適用於三個分析平臺的生物信息分析框架。研究團隊表示，研究開始時BioRad的ddSeq平臺尚未推出，所以未包括在內。

　　

研究概要

　　研究團隊表示，該研究中的單細胞RNA測序平臺各有優缺點，並適用於不同應用。總體來說，10X Genomics的Chromium系統比Drop-seq或inDrop表現更強大，其技術噪音最小，穩定性最高。

　　

三個平臺實驗特徵示意圖及比較

　　該研究發現，基因表達聚類與分析使用的平臺有關，表明存在基因水平的系統特異性量化偏差。研究人員仔細分析了每個平臺中偏差的來源，發現Chromium平臺偏愛較短的序列和GC含量較高的序列，而Drop-seq對GC含量較低的基因檢測效果較好。

　　分析結果顯示，三個平臺在重複性方面都是一致的，表明在同一平臺上可以合併來自多個實驗的檢測數據。但比較不同平臺產生的數據仍非常有挑戰性，為此，研究團隊開發了可適用於三個分析平臺的數據分析框架，方便數據比較。

　　

左：各平臺檢測性能 右：各平臺技術噪音

　　在該研究中，就性能而言，10X Genomics的靈敏度最高，可在3000個基因中平均捕獲17000個轉錄組;Drot-seq檢測到2500個基因的8000個轉錄組；InDrop可檢測到1250個基因的2700個轉錄組。靈敏度高的一個好處就是可以通過較少的reads獲取相同級別的分子標記。此外，10X Genomics平臺的噪音也最少。研究人員認為，inDrop平臺噪音的一個來源是微珠的易變性，因為研究中出現了兩批微珠檢測同一樣本的結果完全不同的情況。

　　該研究還意外發現了不同微珠對檢測結果的影響。研究中的三個平臺都在微珠上附加了條形碼。為了確保一個細胞對應一個條形碼，微珠和細胞都需要進行稀釋。但微珠自身可能會影響稀釋效果，進而影響細胞的捕獲效率。例如，10X Genomics和inDrop都使用水凝膠珠，它們體積大、柔軟靈活，流經系統的速度較低，能夠避免兩個細胞或兩個微珠被包裹在一個水滴中，因此只需要較小的稀釋就能獲得較高的捕獲效率。Drop-seq使用的微珠更小更硬，需要更大的稀釋度避免微珠成對出現，但這會降低細胞捕獲效率。

　　此外，檢測結果表明，10X Genomics微珠的條形碼錯配較少，另外兩個平臺有超過一半的細胞條形碼出現明顯的錯配。其中，Drop-seq約10%微珠的條形碼出現一個鹼基缺失。

　　轉錄組檢測的試驗成本和效率取決於具體場景。為方便研究人員選擇合適的單細胞RNA測序平臺進行研究，研究團隊針對三個平臺的表現與特性給出了指導意見。雖然大多數項目的細胞數量相對較多，但對於稀少樣本，如人類胚胎，需要細胞捕獲效率更高的平臺，10X Genomics是較為合適的選擇。但在三款平臺中，10X Genomics的成本最高，定價為125000美元，僅運行單細胞實驗的平臺為75000美元，估計每個細胞的檢測成本為0.50美元。

　　Drop-seq平臺是較便宜的一個選擇。Drop-seq平臺製造成本為6000美元，購買花費不到30000美元，每個細胞的檢測成本為0.10美元。但目前國內使用Drop-seq的成本明顯高於國外。由於細胞捕獲效率較低，Drop-seq平臺適合樣本豐富的研究，不太適合用於少量樣本和珍貴樣本的檢測。

　　當低豐度轉錄組的檢測可選擇時，選擇inDrop更合適。研究團隊估計inDrop儀器成本約為50000美元，每個細胞檢測成本為0.25美元。InDrop的主要優勢是開放系統，用戶可以根據自己的需求對其進行調整和定製。研究人員表示，inDrop還沒有10X Genomics平臺那麼強大，但預計它會不斷改善。總體來說，這三個平臺都能提供令人滿意的檢測效率。

研究二：Fluidigm、WaferGen、10X Chromium Controller、Illumina/Bio-Rad平臺性能比較

ABRF研究小組針對一組經治療和未經治療的乳腺癌細胞系比較了Fluidigm、WaferGen、10X Chromium Controller和Illumina/Bio-Rad測序平臺在易用性、成本和時間方面的差異。

　　在捕獲能力方面，Fluidigm平臺具有較低的細胞捕獲能力，該平臺最高捕獲400個細胞。除Fluidigm外，其他平臺的捕獲能力約為單臂4000個細胞。在捕獲效率方面，不同單細胞測序平臺的表現不盡相同，如10X Chromium Controller平臺的捕獲效率為65%，WaferGen平臺為30%，而Illumina / BioRad平臺的效率僅為3%。但每個單細胞RNA測序平臺都可以區分已治療和未經治療的癌細胞，只是有些平臺更具有特異性，有些平臺更加適合處理解決治療組的相關問題。

　　就基因檢測結果而言，各檢測平臺在測試條件下具有相似的靈敏度。其中，Fluidigm平臺的表現稍好，其他平臺則差異不大。此外，研究人員發現這些平臺都非常擅長檢測低表達的基因。這四種平臺也存在一些系統特異性偏差，尤其在GC含量和基因長度方面。這與黃巖誼等人的研究結果相似。

　　該研究結果顯示，不同單細胞RNA測序平臺在易用性和周轉時間方面也各不相同。根據報告，10X Chromium Controller和Illumina / BioRad平臺更易於操作人員使用，但Fluidigm HT則被認為使用較為困難。此外，Fluidigm HT-IFC平臺的耗時為12小時，時間最長;Fluidigm 96 IFC、Illumina / BioRad和10X Chromium Controller平臺耗時均約為10小時，相比之下，WaferGen僅用7小時。

　　ABRF研究小組也做了成本分析。Fluidigm HT-IFC方法從細胞捕獲到測序需花費2500美元，每個細胞花費在3.13美元到6.25美元之間，96 IFC方法則花費2000美元，即每個細胞20.83美元;Illumina / BioRad每個細胞花費1~4美元;WaferGen每個細胞約花費3美元;10X Chromium Controller每個細胞花費0.15~1.50美元。

　　由於測序平臺的性能各不相同，所以在不同測序試驗中選擇使用什麼平臺非常重要。實驗人員在選擇測序平臺時需要根據實際情況考慮多種因素，以選擇一種最能滿足試驗需求的平臺。