16款測序平臺性能大PK！人類和細菌基因組DNA水平測序數據研究

DNA是生命遺傳信息的載體，獲取DNA序列信息對於基礎科研和臨床診斷都至關重要。自1977年第一代測序技術問世以來，經過四十餘年的探索，DNA測序技術取得了重大進展。隨著對測序成本降低的需求，以高通量為特點的第二代測序技術（NGS）應運而生並逐步成熟，以單分子測序為特點的第三代測序技術也已經誕生。DNA大規模平行測序已然成為基因組學研究和臨床診斷的重要工具。

目前，能夠完成DNA大規模平行測序的平臺，除了基於邊合成邊測序原理的Illumina平臺和基於半導體測序法的Thermo Fisher平臺外，作為新興測序平臺代表的華大智造DNBSEQ平臺異軍突起，長讀長平臺Oxford Nanopore也呈飛躍式發展。

各家測序儀的「霸主之爭」由來已久，在人類和細菌基因組DNA層面的測序性能到底如何，不同的檢測需求又該如何進行平臺選擇？到底應該如何看待各個平臺的錯誤模式？

近日，由生物分子資源設施協會（Association of Biomolecular Resource Facilities ，ARBF）支持的ABRF NGS II期研究成果發布於預印本平臺BioRxiv。此研究分析了在文庫製備和生物信息可控下， 各大測序平臺的數據，將平臺的性能和測序錯誤模式一一揭示，為各大平臺的「霸主之爭」提供真實全面的參考依據。

1.BRF NGS II 期研究，規模宏大

ABRF於1989年正式組建，成員包括來自41個國家/地區、340個不同核心實驗室的1000多位科學家，成員來自工業界、政府、學術界以及研究機構。ABRF致力於通過研究、交流和教育推進生物技術實驗室的核心競爭力和研究。

在ABRF NGS II期研究中，研究者在多個實驗室內，基於16款測序平臺，對一個人類基因組家族、三個單獨的菌株和十種細菌的宏基因組混合物測序，並將各平臺數據進行多角度比較。

這些平臺包括6款Illumina平臺、3款ThermoFisher Ion Torrent平臺， 2款DNBSEQ平臺（BGISEQ-500和MGISEQ-2000）以及Oxford Nanopore平臺和Genapsys平臺等。數據分析包括各平臺的reads mapping能力，不同平臺的測序覆蓋度、複雜區域的測序錯誤率、不同突變類型的檢出影響因素等。

圖1. 試驗設計圖：各大平臺數據質量都較高，和參考基因組的比對率平均為96.1% (93.0–97.7%)

2.DNA水平測序數據分析，各大平臺各有千秋

基因覆蓋度分析

以25X均一化測序深度後，長讀長和短讀長平臺的基因組覆蓋度均較好。

按照UCSC的 RepeatMask分類，DNA重複序列分為Alu、L1、L2、LTR、微衛星、簡單重複和端粒區域。測序數據顯示，對於DNA重複序列的檢測，平臺各有所長：BGISEQ-500、HiSeq4000 、NovaSeq 2x150bp在捕獲Alu區域時具有優勢，HiSeq 2500、HiSeq X10和NovaSeq 2x150bp在捕獲L1、L2和低複雜度區域表現最佳，PacBio CCS和NovaSeq在微衛星區域和簡單重複區域的測序中表現最好， PromethION平臺的特長則在端粒區域的捕獲。

圖2. 各測序平臺數據基因覆蓋情況分布：a.25X平均測序深度下，UCSC RepeatMask的覆蓋情況；b.基因組平均覆蓋度與所有其他平臺平均覆蓋度

測序錯誤率

分析結果顯示，測序錯誤率與基因組GC含量具有直接相關性。在GC含量比較高的區域(75%-100%)，各平臺的錯誤率均比較高。就錯誤模式而言，華大智造的DNBSEQ平臺和Illumina平臺更傾向於核苷酸替代，而且這兩個平臺比較，靈敏度相當，但華大智造的精度略好；Genapsys平臺和長讀長平臺最主要錯誤來源是插入/缺失。

圖3. 按UCSC-RepeatMask區域的各平臺的測序錯誤率：(a)跨GC-windows的錯誤檢出類型；(b)條形圖顯示各區域類型的總平均錯誤率；(c)均聚物(n=72，687)和短串聯重複序列(n=928，143)區域的錯誤率

SNV和INDEL突變檢測

SNV（單核苷酸變異）和INDEL（插入/缺失突變）是生物DNA常見的突變類型。

在SNV的檢出中， 華大智造的DNBSEQ平臺最為靈敏，其次是NovaSeq 2x250bp、NovaSeq 2x150bp、HiSeq 2500、HiSeq X10和HiSeq4000平臺。對INDEL的檢出中，所有平臺靈敏度均達到99.5%，華大智造的DNBSEQ平臺和NovaSeq的檢出相似，優於其他平臺。PacBio、Nanopore平臺對於SNV和INDEL的捕獲能力均較弱。

圖4. 各平臺SNPs和 INDEL的檢出情況：(a)每個UCSC RepeatMask的SNP和INDEL檢出數量；(b)各平臺對SNP和INDEL突變檢出的靈敏性和特異性；(c)各平臺捕獲INDEL突變的片段大小分布

SV檢測

數據表明， SV（結構變異）的檢出與多因素相關，如SV類型、測序平臺、實驗室間的操作等。

在各平臺數據中，HiSeqX10檢測到SVs數量最多，其次是HiSeq4000和HiSeq2500。檢出假陽性最多的平臺依次是HiSeq2500， HiSeqX10和HiSeq4000。

圖5. 基於不同平臺的SV檢出：a.測序反應中，不同SV類型的檢出分布；b-d.關於SV突變檢出的多角度分析；b.測序平臺；c.實驗室；d.多重突變；e.每100kbwindows的SV檢出。

細菌基因組的捕獲

此研究對於GC不平衡的原核細菌基因組進行了測序分析，包括三種單一菌種和十種細菌的混合物，各樣本分別於MiSeq、Ion PGM和 Ion S5平臺測序。

細菌基因組捕獲的影響因素主要為菌種差異和測序平臺差異。在各個平臺中，ThermoFisher的Ion PM和 S5平臺在錯誤率角度略勝一籌。對於複雜的宏基因組樣本，所有平臺都能夠識別混合物中的所有菌株，但對基因突變的捕獲水平差異較大。

圖6. 細菌基因組測序數據：a.基於各個平臺細菌基因組混合物的檢測結果，各菌種的類型和分布；b.宏基因組中各菌種佔比；c.各個測序平臺，單一菌種和宏基因組混合物的測序錯誤率

3.成熟平颱風採依舊，新興平臺前景可期

ABRF NGS II期研究是迄今為止最全面的DNA測序分析研究之一，此研究跨越不同基因組大小和核苷酸組成，多角度分析揭示了測序平臺之間的特徵差異，以及同一平臺的可變性和可重複性。

綜合各項數據，樣本的GC含量是影響測序錯誤率的主要因素。對單一樣本的DNA測序而言，成熟的平臺如Illumina的表現依舊名列前茅，新興平臺的多項性能已經和成熟平臺不相上下。但就特定區域如Alu的捕獲能力，對SNV、INDEL的檢出和錯誤模式的評估，來自華大智造的DNBSEQ平臺，受益於其獨特的測序文庫方法學，已經獨具優勢。

不可忽略的是，「對於宏基因組樣本，各平臺對樣本變異的捕獲能力差異較大，這表明在複雜背景下對於特定突變的捕獲，仍存在挑戰」， 論文作者、威爾康奈爾醫學院Jonathan Foox教授如是說。

多年來，DNA大規模平行測序的市場一直由Illumina和ThermoFisher等寡頭壟斷。通過此研究，我們欣喜的發現，越來越多的新興測序平臺依託精益求精的性能指標，在「霸主之爭」中不可小覷。

參考資料：

Jonathan Foox .et al，Multi-Platform Assessment of DNA Sequencing Performance using Human and Bacterial Reference Genomes in the ABRF Next-Generation Sequencing Study , bioRxiv ,2020,doi：https://doi.org/10.1101/2020.07.23.218602