現在使用血球計數板計數的實驗室可能相對來講已經比較少了,大都購買了自動計數儀,只要在計數板上滴加10uL細胞懸液,插入儀器中,大概10多秒就能知道細胞密度及活細胞率。之前自己接觸到一次是把血球計數板當做標尺使用。而最近自己也有使用血球計數板對細胞進行計數,發現計數方法並不是全國統一。
首先介紹血球計數板的構造:血球計數板上有5條較深的半圓形凹槽(如圖A所示),其中3條構成呈「H」形(圖B所示),將血球計數板中部分為上下兩區域。這兩個區域都可以進行細胞計數,即一塊板可同時進行兩次計數。
在上下兩區域又被許多小的凹槽分割為若干格子,共含9個大格,每個大格長度為1mm,高度為0.1mm,體積為0.1mm3,圖中5號大格通常稱為計數室,如圖C所示。共有兩種情況,一種是每個大格分割為16個中格(C1),每個中格又被分割成25個小格(D1);另一種為一個大格分割為25個中格(C2),每個中格又被分割成16個小格(D2)。兩種計數板的計數室均被分割成400個小格。
(大格黃色表示,中格藍色表示,小格紫色表示)
計數規則:如果細胞壓線,計左不計右,計上不計下。
計數方法及計算公式:
1、按中格計數
a、如圖D1所示方法:計數室中含16中格,計四角的四個中格;
計算公式:細胞密度/mL=∑中格細胞數÷100×400×104×稀釋倍數
b、如圖D2所示方法:計數室中含25中格,計四角的四個中格及中央中格;
計算公式:細胞密度/mL=∑中格細胞數÷90×400×104×稀釋倍數
2、按小格計數
a、如圖D1:計數室中含16中格,計四角的四個中格中的四角及中央小格;
b、如圖D2:計數室中含25中格,計四角中格的四角及中央中格中格的四角小格;
上述兩種方法均共計20個小格
計算公式:細胞密度/mL=∑小格細胞數÷20×400×104×稀釋倍數
3、按大格計數
a、計1、3、7、9四個大格細胞,
計算公式:細胞密度/mL=∑大格細胞數÷4×104×稀釋倍數
b、計1、3、5、7、9五個大格細胞數
計算公式:細胞密度/mL=∑大格細胞數÷5×104×稀釋倍數
按中格計數為教材或「標準操作」的計數方法。在實際操作過程中,個人傾向於按大格計數的方法,首先計算公式簡單;其次,按大格計算極大程度上削減了因細胞分布不均造成的誤差,最後,按照「標準」計算公式來看,先計算每個小格細胞數,之後×400計算大格細胞數,我們直接計算多個大格的細胞數,求平均值,更能減少誤差。最不推薦的為按小格計算的方法,小格的計算方法最容易受細胞分布的影響。