【實驗目的】了解細胞傳代的一般方法和步驟；進一步熟悉細胞培養的基本原理及培養過程中無菌操作的概念和技術。
【實驗原理】當培養的細胞增殖達到一定密度後，將會出現密度抑制現象，表現為細胞的生長和分裂速度逐漸減慢，甚至停止。此時如果不及時進行分裝再培養，即傳代培養，細胞將逐漸走向衰老、死亡。將培養的細胞從一個容器以1∶2或其他比率轉移到其他容器中擴大培養，稱為傳代培養。貼附型生長細胞採用酶消化傳代法，而懸浮型生長細胞則採用直接傳代法或離心傳代法，以下將分別加以介紹。
【實驗對象】HeLa細胞或T47D細胞。
【實驗材料】器材：CO2培養箱，超淨工作檯，倒置顯微鏡，鼓風乾燥箱，離心機，高壓滅菌器，分析天平，培養瓶，離心管，吸管，移液管，各類吸頭，酒精燈，試管架，酒精棉球，記號筆。試劑：RPMI 1640或DMEM培養液，小牛血清，青黴素，鏈黴素，0.25%胰蛋白酶溶液，Hanks液。
【實驗步驟】（一）貼附型生長細胞的傳代貼附型生長的細胞採用酶消化的方法進行傳代，具體步驟如下：1.細胞的清洗 取已長成或接近長成緻密單層的HeLa或T47D細胞（或原代培養細胞）一瓶，倒去培養液，加入2～3mL Hanks清洗液，輕輕振蕩漂洗細胞後傾去清洗液，以去除殘留的培養液和衰老脫落的細胞及其碎片。2.消化 加入適量（蓋滿細胞面即可）0.25%胰蛋白酶溶液，室溫下（或37℃）消化2～3分鐘後，倒置顯微鏡下觀察細胞面，待培養細胞變成圓形時即可快速倒去消化液（如消化程度不夠時可延長時間）；再加Hanks清洗液輕輕清洗一遍後傾出或直接進行下一步操作。如在酶消化過程中，見細胞大片脫落，表明消化過度，此時為避免細胞大量丟失，不應倒去消化液，而要加入等量的培養液吹打，收集細胞，800r/min離心5分鐘後棄去上清液，再進入下一步。3.接種 在培養瓶中加入3mL培養液（含10%血清）以終止消化。用吸管反覆吹打瓶壁上的細胞層，直到全部細胞被衝下，輕輕吹打混勻，製成單細胞懸液。按1∶2或1∶3分配，接種到2～3個培養瓶內，再向各瓶補加培養液到5mL，也可以取細胞懸液計數，分別按需要的細胞濃度接種到一定數量其他的培養瓶中，再補足培養液進行培養。原代培養的細胞首次傳代時，細胞接種數量要多一些，以使細胞儘快適應新環境，利於細胞生存和增殖，隨消化分離後的組織塊也可一併傳入新的培養瓶（圖5-2）。4.觀察 細胞傳代後，每天應對培養細胞進行觀察，注意有無汙染、培養液的顏色變化情況、細胞貼壁和生長情況等，若細胞貼壁存活則稱為傳代一次。 圖5-2 傳代培養步驟（二）懸浮型生長細胞的傳代因懸浮型生長細胞不貼壁，故傳代時不必採用酶消化法，而可直接傳代或離心收集細胞後傳代。
1. 直接傳代 直接傳代即讓懸浮細胞慢慢沉澱在瓶底後，將上清液吸掉1/2～2/3，然後用吸管吹打形成細胞懸液後再傳代。2.離心傳代（1）在超淨臺內用吸管將培養瓶中的細胞吹打均勻，尤其是將半貼壁的細胞吹打起來。（2）將細胞懸液吸入離心管中，蓋緊膠蓋，與另一離心管配平後，置離心機中800～1000r/min離心5分鐘。（3）回到超淨臺操作，棄上清液，加入適量新培養液，用吸管吹打均勻，製成單細胞懸液。（4）按1∶2或1∶3分配傳代培養，也可以計數後根據所需要的細胞濃度傳至已準備好的新培養瓶或培養皿中，放入CO2培養箱中繼續培養。
【結果與分析】1.根據細胞種類和狀態的不同，細胞消化時間會有所差異，在你的實驗過程中，細胞消化的程度如何？消化結束時你是如及時終止此過程的？2.在細胞傳代後，細胞重新貼壁大概用了多長時間？觀察細胞從一次傳代後到下一次傳代所經歷的生長過程。