細胞在體外培養中所需的條件與體內細胞基本相同，但隨細胞生存環境的改變也會出現一定的差異。
1.無汙染的細胞培養環境 無菌無毒的操作環境和培養環境是保證細胞在體外培養成功的首要條件。在體外培養的細胞由於缺乏對微生物和有毒物的防禦能力，一旦被微生物或有毒物質汙染，或者自身代謝物質積累，可導致細胞中毒死亡。因此，在體外培養細胞時，必須保持細胞生存環境無汙染，並及時清除細胞代謝產物。要保持無菌無毒環境，必須嚴格做到：細胞培養用品及培養用液要經過滅菌處理，實驗過程要嚴格按照無菌操作規程進行。
2.恆定的溫度 維持培養細胞體外生存，必須有恆定適宜的溫度。人和哺乳動物細胞培養的標準溫度為36.5℃±0.5℃，偏離這一溫度範圍，細胞的正常代謝會受到影響，甚至死亡。培養細胞對低溫的耐受力比高溫強，溫度上升不超過39℃時，細胞代謝與溫度成正比。溫度39℃～40℃1小時，細胞有一定的損傷，但仍有可能恢復；若將細胞放在40℃～41℃1小時，細胞會普遍受到損傷，僅少半數有可能恢復；溫度41℃～42℃1小時，細胞受到嚴重損傷，大部分細胞死亡，個別細胞仍有恢復可能；當溫度在43℃以上1小時，細胞全部死亡。培養溫度低至25℃～35℃時，細胞仍能生存和生長，但速度緩慢。放在4℃數小時後，再回到37℃培養，細胞仍能繼續生長。細胞代謝隨溫度降低而減慢，當溫度降至冰點以下時，細胞可因胞質結冰受損而死亡。但是，如果向培養液中加入一定量的冷凍保護劑（二甲基亞碸或甘油），可在深低溫下，如-80℃或-196℃（液氮）長期保存。
3.氣體環境 氣體是體外培養細胞生存的必需條件，所需要的氣體主要有氧氣和二氧化碳。氧氣參與三羧酸循環，產生供給細胞生長增殖的能量和合成細胞生長所需用的各種成分。二氧化碳既是細胞代謝產物，也是細胞生長繁殖所需成分，它在細胞培養中的主要作用在於維持培養基的pH值。
4.pH條件 大多數細胞的適宜pH為7.0～7.4，偏離這一範圍對細胞培養將產生有害的影響。各種細胞對pH的要求也不完全相同，原代細胞對pH的波動比較敏感，耐受性差；永生化細胞株耐受性強。但細胞耐酸性比耐鹼性大一些，在偏酸環境中更利於細胞生長。細胞培養液pH濃度的調節最常用的為加NaHCO3的方法，因為NaHCO3可供CO2，但CO2易於逸出，故最適用於封閉培養。
5.滲透壓 人血漿滲透壓約290mmol/L（290mOsm/kg），可視為培養細胞的理想滲透壓。對大多數細胞來說，滲透壓在260～320mmol/L（260～320mOsm/kg）範圍都適宜。
6.水的質量 水是細胞中含量最高的物質，是維持細胞生命活動必不可少的物質。體外培養的細胞對水的質量非常敏感，在培養用液中任何對細胞有害的物質都會影響培養細胞的生存。因此，要求培養細胞用液必須使用新鮮三蒸水或去離子水配製。
7.細胞培養基 培養基是體外培養細胞中供給細胞營養和促使細胞生長增殖的基礎物質，也是體外培養細胞生長和繁殖的生存環境。細胞培養基的種類很多，按其來源分為合成培養基和天然培養基（目前使用的培養基絕大部分是合成培養基），按其物質狀態分為乾粉培養基和液體培養基兩類。乾粉培養基須由實驗者自己配製並滅菌，液體培養基由專業商家提供，用戶可直接使用，非常方便。