細胞凋亡檢測——萬融實驗

2021-01-14 實驗室小知識

細胞凋亡或稱程序性細胞死亡（programmed cell death，PCD），是細胞的生命現象之一，在機體的胚胎發育、組織修復及自身反應性T淋巴細胞的清除等方面起著十分重要的作用。細胞凋亡調節的失控可導致臨床各種疾病的發生，如腫瘤與細胞凋亡的抑制有關。細胞凋亡有別於細胞壞死，它有一系列的細胞形態學和生物化學的改變，包括出現染色質濃縮、DNA降解、凋亡小體形成等。

Annexin－Ⅴ－FITC單染法

【實驗原理】

正常活細胞的磷脂醯絲氨酸（phosphotidylserine，PS）位於細胞膜的內側，而凋亡細胞的PS從細胞膜的內側翻轉到細胞膜的表面，暴露在細胞外環境中。Annexin－Ⅴ（膜聯蛋白－Ⅴ）是一種相對分子質量為35000～36000的Ca2＋依賴性磷脂結合蛋白，能與PS高親和力結合。因此，將Annexin－Ⅴ進行螢光素（如FITC、PE）或生物素（Biotin）標記，以標記了的Annexin－Ⅴ作為探針，利用流式細胞儀或螢光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發生。

【材料和儀器】

1.500μl或250μl20μg／mlAnnexin－Ⅴ－FITC（膜聯蛋白－Ⅴ－FITC）。

2.40ml或20ml標記緩衝液（Binding Buffe）。

3.60ml或30mlPBS（1×）、去離子水、冰塊。

4.20μl、200μl及1000μl移液器和吸頭、微量離心管、蓋玻片（用於螢光顯微鏡觀察）。

5. 可調速離心機、載玻片（用於螢光顯微鏡觀察）、流式細胞儀或螢光顯微鏡。

【實驗方法】

1. 凋亡細胞的製備：小鼠腹腔注射地塞米松25mg／kg體重，10h後解剖取胸腺，分離胸腺細胞。用PBS洗兩遍，調整細胞濃度為2×106／ml，備用。

2. 取200μl細胞懸液加入1ml冷PBS，輕輕震蕩使細胞懸浮，1000r／min4℃離心10min，棄上清，共三次。

3.將細胞重懸於200μl標記緩衝液中。

4.加入10μlAnnexin－Ⅴ－FITC，輕輕混勻，避光室溫反應15min或4℃反應30min。

5.加入300μl標記緩衝液，立即鏡檢或上機（流式細胞儀）檢測。

【實驗結果】用螢光顯微鏡觀察，凋亡細胞細胞膜上可見黃綠色光環（圖14-1）。用流式細胞儀分析可檢測凋亡細胞的百分率。

圖14-1　凋亡細胞的Annexin－Ⅴ－FITC單染法結果

【注意事項】

1. 整個操作過程動作要儘量輕柔，切勿用力吹打細胞，儘量在4℃下操作。2.反應完畢後要儘快檢測，因為細胞凋亡是一個動態的過程，反應1h後螢光強度就開始衰變。3.Annexin－Ⅴ－FITC是光敏物質，在操作時要注意避光。

【思考題】

1. Annexin－Ⅴ－FITC單染法為什麼能檢測凋亡細胞？

2. 實驗前為什麼要給小鼠注射地塞米松？其原理是什麼？

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