細胞凋亡檢測,流式如何做到全覆蓋?(嘔心瀝血之作)

2021-01-21 流式中文網

凋亡，又叫程序性細胞死亡，是正常發育和人體細胞平衡的一種精細調節方式。凋亡與細胞壞死不同，後者是一種突發性的細胞死亡，非生理性的。

如果發生凋亡調節機制的異常，通常會導致癌症、自身免疫性疾病或退化性疾病。


凋亡在形態上主要表現為細胞皺縮、細胞滲透性增高、膜不對稱性改變、染色質濃縮、DNA片段化、細胞出泡等，發生凋亡的細胞最後通過巨噬細胞胞吞作用清除。


沒有一個指標可以明確細胞死亡的性質，因此，利用流式細胞術的多參數能力，可在一個樣本中同時進行多種指標檢測，揭示細胞死亡的性質。


從凋亡的早期、中期到晚期，在流式上都有相應的方法可用枟檢測。



JC-1是一種廣泛使用的線粒體膜電位檢測陽離子染料，它可進入帶負電荷的線粒體內聚積形成聚集體，並488nm螢光激發，發出以紅光為主的光譜，故在FL1/FL2散點圖上，位於雙陽性區域（見下圖左側小圖）。在凋亡早期，線粒體膜電位會發生下降，此時，JC-1解離為單體，發出綠光，故此時在FL1/FL2散點圖可看到一類FL1增強而FL2明顯下降的細胞（見下圖右側小圖）。詳細protocol參見論壇：http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-3549-1-1.html




DiIC1(5) (1,1』3,3,3』3』-hexamethylindocarbocynanine iodide)是另一種陽離子線粒體膜電位染料，635nm激發，發紅光，當線粒體膜電位降低時，可出現螢光強度降低。DiIC1(5) 通常在APC通道檢測，所以比較容易與其它指標一起檢測。

MitoTracker是另一種商品化線粒體膜電位探針，488nm激發，發紅光，主要在PE通道檢測，同樣在膜電位降低時螢光強度發生降低。




細胞內蛋白酶的級聯活化，是凋亡的一個重要性標誌，這些蛋白酶主要是caspase。caspase開始以非活化的pro-caspase狀態存在，當凋亡發生時，可被剪切成活化狀態。活化狀態的caspase酶可使沒有螢光的caspase底物發出螢光。

目前檢測的caspase種類主要是3和7，當然，1、2、8、10、11、12、13也有，在此不詳述，參見：http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-1535-1-1.html

下圖是Jurkat細胞用staurosporine處理後誘導的凋亡增多，可見caspase-3底物螢光增高。



詳細方法參見論壇：

http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-192-1-1.html

http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-3111-1-1.html



一些單聚體染料，例如PO-PRO（405nm激發）、YO-PRO-1（488nm激發）、TO-PRO-3（635nm激發）等，可透入凋亡的細胞膜，結合只能染死細胞的染料（例如PI或7-AAD等），就可以區分出凋亡和壞死。

如下圖，右下象限是凋亡，右上象限是壞死。



隨著凋亡的進行，膜對稱性開始喪失，磷脂醯絲氨酸（PS）一般位於活細胞膜內測，對稱性的消失意味著PS隨膜翻轉而暴露於膜外側，從而可被Annexin V檢測到。不過Annexin V的結合依賴於鈣離子和鎂離子，所以你在染色緩衝液中記得要加入這兩種離子。




可使用PI、7-AAD、Hoechst33342等染料。

詳細方法參見：

http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-1330-1-1.html

http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-3496-1-1.html


末端脫氧核苷酸轉移酶（TdT）-dUTP標記，主要是將TdT摻入斷裂DNA的末端，實現檢測末期凋亡。



詳細protocol參見：

http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-198-1-1.html



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