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細胞凋亡（apoptosis）是一種有序的或者程序性的細胞死亡方式，是細胞受到特定基因調控後的主動性死亡過程，也是正常的細胞生理應答反應，凋亡的細胞最終將被體內吞噬細胞處理。過度的細胞凋亡將直接導致組織器官功能的下降；而對於癌細胞來說，凋亡過程中斷則意味著癌症的發展和擴散。
通常可分為3個階段。第1階段是細胞的間接觸消失，但是胞膜尚完整，粗面內質網上的核糖體脫落，細胞核出現固縮表現，本階段持續時間很短；第2階段是細胞核碎裂後與細胞內的各種細胞器結合，並進一步被質膜包裹形成凋亡小體；第3階段是吞噬細胞吞噬凋亡小體，並將其消化為重新供機體使用。
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3、 凋亡檢測方法匯總
3.1 光學顯微鏡
染色細胞：常用HE染色或Giemsa染色等。凋亡細胞呈圓形，胞核深染，胞質濃縮，染色質成團塊狀，細胞表面有「出芽」現象。鏡下可見凋亡細胞的染色質濃縮、邊緣化，核膜裂解、染色質分割成塊狀和凋亡小體等典型的凋亡形態。在HE染色的組織切片中細胞體積縮小，胞質緻密、嗜酸性染色增強，並可形成凋亡小體。本方法僅用於調亡現象的初步觀察，重複性較差，對於凋亡不明顯的情況判定效果一般。
未染色細胞：凋亡細胞的體積變小、變形，細胞膜完整但出現發泡現象，細胞凋亡晚期可見凋亡小體。貼壁細胞出現皺縮、變圓、脫落。
3.2 螢光顯微鏡
一般以細胞核染色質的形態學改變為指標來評判細胞凋亡的進展情況。常用的DNA特異性染料有：HO 33342（Hoechst 33342），HO 33258 （Hoechst 33258），DAPI。三種染料與 DNA 的結合都是非嵌入式的，主要結合在DNA的A-T鹼基區。紫外光激發時發射明亮的藍色螢光。Hoechst 是與DNA 特異結合的活性染料。DAPI為半通透性，用於常規固定細胞的染色。
3.3 透射電鏡
電子顯微鏡是觀察細胞形態最好的方法，細胞核和細胞器的結構清晰易辨。凋亡細胞染色質固縮並凝結成塊，聚集在核膜周邊呈新月狀或環狀小體，細胞漿濃縮，內質網變疏鬆並與胞膜融合，形成一個個空泡，線粒體結構無明顯改變。細胞凋亡的晚期，細胞核裂解為碎塊，產生凋亡小體。壞死細胞的染色質稀疏呈細顆粒狀，分布無規律，邊界不清，細胞漿腫脹，細胞器結構破壞，細胞膜不完整。
透射電鏡標本經戊二醛和餓酸雙重固定，丙酮脫水，環氧樹脂包埋，超薄切片，醋酸枸椽酸電子又重染色，透射電鏡觀察。掃描電鏡標本經戊二醛和餓酸雙重固定，乙醇逐級脫水，CO2臨界點乾燥，真空噴金，掃描電鏡觀察。
結果判斷：凋亡細胞體積變小，細胞質濃縮。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的細胞核內染色質高度盤繞，出現許多稱為氣穴現象（cavitations）的空泡結構；Ⅱa 期細胞核的染色質高度凝聚、邊緣化；細胞凋亡的晚期，細胞核裂解為碎塊，產生凋亡小體。
（圖片來自網絡，僅交流學習使用）
（圖片來自網絡，僅交流學習使用）
在細胞凋亡早期位於細胞膜內側的磷脂醯絲氨酸（PS)遷移至細胞膜外測。磷脂結合蛋白V（Annexin V）是一種鈣依賴性的磷脂結合蛋白，它於PS具有高度的結合力。因此，Annexin V可以作為探針檢測暴露在細胞外測的磷脂醯絲氨酸。故利用對PS有高度親和力的Annexin V，將Annexin V標記上螢光素（如異硫氰酸螢光素FITC），同時結合使用PI拒染法（因壞死細胞PS亦暴露於細胞膜外測，且對PI高染）進行凋亡細胞雙染法後用流式細胞儀即可檢測凋亡細胞。
細胞發生凋亡時，膜上的PS外露早於DNA斷裂發生，因此Annexin V聯合PI染色法檢測早期細胞凋亡較TUNEL法更為靈敏，更加省時，結果更為可靠，是目前最為理想的檢測細胞凋亡的方法。但是同時需注意的是凋亡後期溶解階段，細胞碎片也可出現明顯的陽性著色。
3.5、線粒體膜勢能的檢測
（圖片來自網絡，僅交流學習使用）
線粒體在細胞凋亡的過程中起著樞紐作用，多種細胞凋亡刺激因子均可誘導不同的細胞發生凋亡，而線粒體跨膜電位（Δψm）的下降，是細胞凋亡級聯反應過程中最早發生的事件，它發生在細胞核凋亡特徵（染色質濃縮、DNA 斷裂）出現之前，一旦線粒體跨膜電位崩潰，則細胞凋亡不可逆轉。
線粒體跨膜電位的存在，使一些親脂性陽離子螢光染料如Rhodamine123、DiOC6、JC-1、TMRM等可結合到線粒體基質，其螢光的增強或減弱說明線粒體內膜電負性的增高或降低。
但是，這種方法不能區分細胞凋亡或其他原因導致的線粒體膜電位的變化。
3.6、DNA Ladder法
細胞凋亡時主要的生化特徵是其染色質發生濃縮，染色質 DNA 在核小體單位之間的連接處斷裂，形成 50~300 kbp 長的 DNA 大片段，或 180~200 bp 整數倍的寡核苷酸片段，在凝膠電泳上表現為梯形電泳圖譜（DNA ladder）。
此現象可用常規瓊脂糖凝膠電泳檢測，是凋亡的特徵。由於該技術只能提供細胞死亡的定性分析，一般要結合定量的方法以確定樣品的凋亡程度。另有需注意的重要之處，一些細胞類型或細胞系(如K562，10T1/2，Raji)在凋亡時不是以此種方式斷裂DNA，另外在壞死細胞中也不發生這樣的DNA裂解。這不是凋亡細胞的限定性試驗，但不論在何系統中，這都是確定細胞死亡有用的特性。
此外，DNA Ladder法對於較多細胞出現凋亡的情況較為敏感，但是對於凋亡細胞比例很小的情況則不敏感。
3.7 連接介導的PCR檢測
當凋亡細胞比例較小以及檢測樣品量很少（如臨床組織活檢）時，直接瓊脂糖電泳可能觀察不到核DNA的變化。然而CLONTECH公司的ApoAlert®LM-PCR Ladder Assay Kit通過LM-PCR（ligation-mediated PCR）,連上特異性接頭，專一性地擴增核小體的梯度片段，從而靈敏地檢測凋亡時產生的核小體的梯度片段。此外，LM-PCR檢測是半定量的，因此相同凋亡程度的不同樣品可進行比較。
細胞凋亡過程中核酸內切酶在DNA分子核小體間的降解，導致小分子DNA漏出，核DNA含量下降，細胞螢光染色後作流式細胞儀分析，可以發現在DNA直方圖上正常二倍體細胞的Go/G1峰前出現一個亞二倍體峰（xub-G1峰，即apoptotic peak）,代表凋亡細胞。根據此亞二倍體峰可以計算凋亡細胞的百分率。此外，流式細胞術還可以通過測定線粒體膜的電位、溶酶體質子泵的活性及細胞DNA/總蛋白質比例等方法辨認凋亡細胞。
此法應用廣泛，適用於石蠟組織切片、冰凍切片以及細胞培養物等等。檢測靈敏，但其自發螢光是需要注意的地方。
Caspase家族在介導細胞凋亡的過程中起著非常重要的作用。對於凋亡而言，最有價值的基因和蛋白就是Caspase3（32KD），因為Caspase3是幾乎所有凋亡信號通路的「終點」，其基因蛋白的表達水平是評價凋亡的重要指標。此外一定要檢測Caspase3蛋白的剪切後活化體（17KD、12KD），即cleaved-Caspase3蛋白的表達水平，只有活化了的Caspase3才有功能。
此法是目前應用較為廣泛的方法，畢竟PCR和Western blot可是咱們的看家本領啊。
細胞色素C在細胞凋亡中發揮著重要的作用。正常情況下，細胞色素C暫存於線粒體膜間隙之中，胞漿中沒有。一旦Bax/Bcl-2蛋白的比例發生改變，細胞色素C就會釋放到胞漿中，並進一步激活Caspase9，引起凋亡級聯反應。
在早期，有一部分研究人員對細胞色素C尤其關注，近年使用的較少。值得注意的是採用此法，必須將胞漿和線粒體中細胞色素C區分開來研究，否則很難說清楚，因此組織或細胞培養物勻漿後差速離心必不可少。
研究發現，90%以上的癌細胞或凋亡細胞都具有端粒酶的活性，而正常體細胞是沒有端粒酶活性的。
Intergen公司提供的一款試劑盒，名叫TRAP-eze Telemerase Detection Kit。它提供特定的寡核苷酸底物，能夠分別與底物及端粒重複序列配對的引物。如果待測樣本中含有端粒酶活性，就能在底物上接上不同個數的6鹼基（GGTTAG）端粒重複序列，通過PCR反應，產物電泳檢測就可觀察到相差六個鹼基的DNA Ladder現象。（這個小編未接觸過，在搜索資料時發現，故貼上）。
最後小編想友情贈送大家一些非常有用的資料。
包括DNA Ladder實驗步驟、TUNEL凋亡檢測步驟、流式細胞術原理及方法、冷泉港細胞實驗指南。
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This is the dividing line.
以上為本期內容，細胞凋亡概念及檢測方法。
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