細胞凋亡原理
細胞死亡根據其起源、性質及生物學意義區分為凋亡、壞死兩種類型。
細胞凋亡普遍存在於生命界，它是細胞在一定生理條件下一系列順序發生事件的組合，是細胞遵循一定規律自己結束生命的自主控制過程，具有可鑑別的形態學和生物化學特徵。
細胞壞死是細胞處於劇烈損傷條件下發生的細胞死亡。
溫和損傷刺激及抗腫瘤藥物等因素在誘導細胞凋亡的同時，也可產生細胞壞死，這取決於損傷的劇烈程度和細胞本身對刺激的敏感程度。
檢測細胞凋亡方法匯總
——豐暉生物提供細胞凋亡檢測
1. Hoechst33342和碘化丙啶（propidium iodide，PI）螢光探針雙標記法
作用原理：當細胞壞死時，質膜不完整，PI就進入細胞內部，它可嵌入到DNA或RNA中，使壞死細胞著色（紅色），凋亡細胞和活細胞不著色。Hoechst33342是一種親脂性活性螢光染料且毒性較弱的雙苯並咪唑衍生物，可跨膜進入活細胞與DNA特異結合（主要結合於A-T）鹼基區），顯示活細胞（藍色）。凡是看到有凋亡小體的細胞都是凋亡細胞。
因此，用Hoechst33342和碘化丙啶（propidium iodide，PI）對細胞進行雙重染色，可以區別凋亡、壞死及正常細胞。
實驗結果顯示如下：
2. Annexin V/PI雙染色法
作用原理：磷脂醯絲氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位於細胞膜的內側，但在細胞凋亡的早期，PS可從細胞膜的內側翻轉到細胞膜的表面，暴露在細胞外環境中(下圖)。
Annexin-V是一種分子量為35~36 KD的Ca2+依賴性磷脂結合蛋白，能與PS高親和力特異性結合。將Annexin-V進行螢光素（FITC、PE）或biotin標記，以標記了的Annexin-V作為螢光探針標記，利用流式細胞儀或螢光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發生（綠色）。
碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但在凋亡中晚期的細胞和死細胞，PI能夠透過細胞膜而使細胞核紅染（紅色）。因此將Annexin-V與PI匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細胞以及死細胞區分開來。
螢光顯微鏡檢測（Annexin-V綠色、紅色PI）
流式細胞儀檢測
3. TUNEL法
作用原理：脫氧核糖核苷酸衍生物地高辛[（digoxigenin）-11-dUTP]在TdT酶的作用下，可以摻入到凋亡細胞雙鏈或單鏈DNA的3-OH末端，與dATP形成異多聚體，並可與連接了報告酶（過氧化物酶或鹼性磷酸酶）的抗地高辛抗體結合。在適合底物存在下，過氧化物酶可產生很強的顏色反應，特異準確的定位出正在凋亡的細胞，因而可在普通光學顯微鏡下進行觀察。
4. Caspase-3活性檢測法
作用原理：Caspase家族在介導細胞凋亡的過程中起著非常重要的作用，其中caspase-3為關鍵的執行分子，它在凋亡信號傳導的許多途徑中發揮功能。Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在於胞漿中，在凋亡的早期階段，它被激活，活化的Caspase-3由兩個大亞基（17KD）和兩個小亞基（12KD）組成，裂解相應的胞漿胞核底物，最終導致細胞凋亡。但在細胞凋亡的晚期和死亡細胞，caspase-3的活性明顯下降。
Western blot 法分析Procaspase-3的活化，以及活化的Caspase-3及對底物多聚（ADP-核糖）聚合酶[poly（ADP-ribose）polymerase，PARP]等的裂解。
流式細胞術分析收穫細胞正常或凋亡細胞→PBS洗滌→加Ac-DEVD-AMC→37°C反應1 h→UV流式細胞計分析caspase-3陽性細胞數和平均螢光強度。
Western blot 法
流式檢測法
5. 形態學檢測法
根據凋亡細胞固有的形態特徵，使用透射電鏡檢測凋亡細胞形態變化。
凋亡細胞體積變小，細胞質濃縮。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的細胞核內染色質高度盤繞，出現許多稱為氣穴現象（cavitations）的空泡結構(圖2)；Ⅱa期細胞核的染色質高度凝聚、邊緣化；細胞凋亡的晚期，細胞核裂解為碎塊，產生凋亡小體。
豐暉生物實驗室
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