「Protocol」ROS檢測步驟,兼顧超氧化物檢測

測量ROS的產生或氧化應激有多種方法，其中，使用最廣泛的螢光探針是2',7'二氯二氫螢光素二乙酸酯（DCFH2-DA），該分子是無色和親脂的。 DCFH2-DA通過細胞膜進入細胞內，受到細胞內酯酶的作用，脫乙醯化變成DCFH2，無法再透過細胞漏出。多種類型的ROS（過氧化氫，過氧亞硝酸鹽，羥基自由基，一氧化氮和過氧自由基）均可對DCFH2產生作用，使其進一步氧化為螢光的DCF（Ex/Em：485–500 nm/515–530 nm），可以在流式細胞儀相應通道檢測到（常見為FL1通道）。

超氧化物不會與DCFH2發生強烈反應，但會與另一種探針二氫乙啶（DHE）反應，產生螢光產物2-羥基乙啶（以及其他與螢光無關的超氧化物氧化物）。可以使用518 nm的激發波長和605 nm的發射波長（常為FL2通道）檢測DHE氧化的螢光產物。

儘管使用起來相對簡單，但要利用這些探針檢測ROS需要了解其局限性，並做好染色細節，設置好正確的對照，方可獲得有效的實驗結果和結論。

ROS試劑準備

•在60μL無水DMF（N，N-二甲基甲醯胺）中溶解凍幹的DCFH2-DA，得到5 mM儲存液。使用前輕輕混合。（注意：在-20°C下，配製的試劑保質期約為1周。故配好後應立即將試劑分裝到避光小瓶中，可以最大程度地減少其氧化，這樣在-20°C時具有最長的保存期限。）•在60μL無水DMF中溶解凍幹的DHE，得到5 mM儲備液。使用前輕輕混合。•在20μL無水DMF中溶解ROS誘導劑（Pyocyanin，綠膿菌素），得到50 mM儲存液。•在123μL去離子水中溶解ROS抑制劑（N-acetyl-L-cysteine，N-乙醯基-L-半胱氨酸），得到0.5 M的儲存液。•向無酚紅的DMEM中添加0.1％FBS，製備低血清DMEM（無酚紅）。•將抗BSA抗體分裝成小等分試樣（取決於使用情況）並將其儲存在-80°C下。•用HBSS（Hanks』 balanced salt solution）或PBS中配製100mg/mL BSA儲備液。分裝成100μL等分試樣，並保存在-20°C下。•準備ROS探針的2x溶液：每10 mL低血清DMEM，添加4μL DCFH2-DA和4μL DHE。•與上一條類似，準備僅包含DCFH2-DA的2x探針溶液，再準備僅包含DHE的2x探針溶液。

測定條件和對照用於每個實驗的流式補償對照：

•未染色和未刺激的細胞。•僅用DCFH2-DA染色的細胞，並用ROS誘導劑處理。•僅用DHE染色的細胞，並用ROS誘導劑處理。

對於每批次樣本，包括以下6種對照：

•未染色和未刺激的細胞•染色和未刺激的細胞•用陽性誘導劑處理的染色細胞•用陽性誘導劑和ROS抑制劑處理的染色細胞（確保陽性誘導的特異性）

染色步驟

•用ROS 2x探針溶液，對綠膿菌素儲存液進行1:100稀釋，製備為2x陽性誘導劑溶液，即500μM的綠膿菌素（終濃度為250μM）。同樣，將綠膿菌素1:100分別稀釋到前述「僅包含DCFH2-DA的2x探針溶液」和「僅包含DHE的2x探針溶液」中，得到對應的單陽性誘導劑溶液。•通過將BSA儲存液稀釋到2x探針溶液中來製備2x BSA溶液，以獲得2μg/ mL的濃度（終濃度為1μg/ mL）。•在開始特定刺激（FcγR交聯）之前，請確保所有試劑和細胞均已準備就緒。按照刺激順序將試管放在冰上。•對於帶有自動進樣器的流式細胞儀，請注意流式細胞儀獲取兩個樣品之間所花費的時間，包括任何混合和探針洗滌步驟（例如3.5分鐘）。注意：定時對於ROS測定非常關鍵。為了很好地控制條件，需要為每管在準確的時間（30分鐘）內按順序刺激，並上機採集樣品，例如，如果流式細胞儀獲取兩個樣本之間所需的時間為3.5分鐘，則按每3.5分鐘對樣本按照分析的順序刺激。•每管樣本，均避光，於37°C，5％CO2下，與「測定條件和對照」對應的試劑孵育30分鐘。•上機檢測。

分析

用「測定條件和對照」的補償對照，調節補償（green probe=DCFH2-DA單染，orange probe=DHE單染）：

用上述補償，分析實驗樣本：

參考文獻：Shehat MG, Tigno-Aranjuez J. Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To FcγR Cross-linking. J Vis Exp. 2019;(145):10.3791/59167. Published 2019 Mar 7. doi:10.3791/59167

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