細胞培養一定要保持工作區的無菌清潔，先用紫外燈和臭氧殺菌1h，然後通風30min，操作前需要換細胞間專用拖鞋，雙手帶上一次性橡膠手套並用75%乙醇消毒，穿上實驗服，戴上一次性口罩和帽子，整個無菌操作都應該在酒精燈的周圍進行。
1. 取對數生長期的貼壁細胞，棄掉舊培養基。
2. 用磷酸鹽緩衝液（PBS）衝洗細胞1-2遍。 (每10 cm2 培養表面積需要2 ml 溶液)。從與貼壁細胞層相對的容器一側輕輕加入衝洗液，以避免攪動細胞層，前後搖晃容器數次。
註：衝洗步驟可去除可能抑制消化酶作用的少量血清、鈣和鎂。
3. 從培養容器中吸出衝洗液並丟棄。
4. 向培養瓶中加入預熱的消化酶(例如：胰蛋白酶)；試劑量應足以覆蓋細胞層 (每10 cm2 大約0.5ml)。輕輕搖晃容器，使試劑完全覆蓋細胞層。
5. 將培養容器在室溫下孵育約2分鐘。
請注意，實際孵育時間根據所用細胞系不同可能有所差異。
6. 在顯微鏡下觀察細胞解離情況。如果解離程度未達90%，可將孵育時間延長几分鐘，每30秒鐘檢查一次解離情況。也可輕輕拍打培養容器以加快細胞解離。
7. 細胞解離程度大於等於90%時，傾斜培養容器，使細胞上液體儘快流盡。加入所用消化酶兩倍體積的預熱完全生長培養基。輕柔吹打細胞層表面數次，使細胞分散，成為單細胞懸液。
8. 將細胞轉移到 15ml 離心管中，200g 離心5至10分鐘。
請注意，離心速度和時間依細胞種類不同而有所差異。
9. 用最少體積的預熱完全生長培養基重新懸浮細胞沉澱。
註：此時可進行細胞計數
10.將細胞懸液稀釋到該細胞系推薦的接種密度，並將適量體積的細胞懸液轉移到新的細胞培養容器中，把細胞放回培養箱。
註：如果使用培養瓶，將其放入培養箱前應將瓶蓋旋鬆，以便進行充分的氣體交換，除非您使用的是通氣式培養瓶和透氣性瓶蓋。