小鼠小膠質細胞原代培養方法

2020-08-27 百歐博偉生物



微生物查詢網：組成中樞神經系統的細胞大部分是神經膠質細胞，包括大膠質細胞（星型膠質細胞和少突膠質細胞）和小膠質細胞。小膠質細胞是中樞神經系統的主要免疫細胞，具有提呈抗原、分泌多種細胞因子、吞噬病原體和壞死組織的作用，被認為是腦內的單核巨噬細胞。由於小膠質細胞在顱內免疫反應中的重要作用，對小膠質細胞的研究已成為熱點。

小膠質細胞的體外培養是小膠質細胞功能研究的重要途徑，在此本文將給大家梳理一下小鼠小膠質細胞原代培養。

一、實驗動物：

新生 24h 內清潔級小鼠。

二、主要試劑：

1、PBS：用購自中山公司的PBS粉劑，每袋加ddH2O定容至1000ml，調pH7.2，高壓滅菌消毒。

2、0.25%胰蛋白酶消化液：使用時濃度為0.25%，含0.02%EDTA，製備時即取250mg胰酶和20mgEDTA溶於100mLPBS溶液，並在無菌操作臺上用0.22um一次性過濾器過濾，50ml分裝，4℃保存。

3、接種液配製：用DMEM-F12 基礎培養90%，再加入10%胎牛血清，最後按1％體積分數加入雙抗貯存液(青黴素+鏈黴素)，使青黴素和鏈黴素的終濃度分別為100 U／mL和100 U／mL，置於4℃冰箱保存。

4、抗生素：青黴素(80萬U)和鏈黴素(100萬U)在無菌操作臺內以高壓滅菌過的雙蒸水溶解分別加入4ml滅菌水/青黴素，5ml滅菌水/鏈黴素)，配製成20萬u/ml分裝，置於-20℃冰箱保存，臨用時4℃解凍，注意儘量避免反覆凍融，並使培養基最終濃度為100 u/ml。

5、0.01% L-多聚賴氨酸溶液的配製：稱量 10mg L-多聚賴氨酸，溶於 100ml 滅菌去離子水，0.22μm 正壓濾器過濾分裝，-20℃保存。

6、0.4%臺盼藍溶液的配製

臺盼藍 4 g

PBS 少許（研磨）

PBS 定容至 100ml，濾紙過濾，室溫保存。

7、4%多聚甲醛的配製：

多聚甲醛 4 g

PBS 溶液 100ml

加熱至 60℃，邊滴加 1mol/L NaOH 邊攪拌，至液體澄清。

8、四噻唑蘭溶液配製：

MTT 50mg

PBS 10ml

磁力攪拌 30min，滅菌 0.22µm 微孔濾膜過濾分裝，4℃保存，兩周有效。

三、實驗步驟：

1、培養板的包被

（1）將蓋玻片裁成 0.5cm×0.5cm 大小，浸洗、烘乾。

（2）經 5%鹽酸浸泡30min，自來水衝洗20min，三蒸水衝洗，浸泡過夜並烘乾；移入 95%酒精浸泡保存。用前酒精燈烤乾，放入 24 孔細胞培養板。

（3）用 0.01%的 L-多聚賴氨酸溶液包被培養皿和小玻片，37℃恆溫孵育 4h 或常溫過夜。

去除 L-多聚賴氨酸溶液，滅菌去離子水漂洗培養孔及小玻片，晾乾備用。

2、小鼠小膠質細胞的混合培養

（1） 75%（體積分數）酒精消毒新生 24h 內的清潔級小鼠，在無菌條件下斷頭，剪開頭皮及顱骨，取出腦組織，置於盛冷的pH7.2,無鈣、鎂的D-Hank's液的平皿中（下置冰袋）。

（2） 無菌剝離腦組織，除去小腦、海馬、大腦髓質,分離大腦皮層，仔細剝離腦膜及血管。

（3）用虹膜剪將組織剪切成 1mm3左右的組織塊，0.125%胰蛋白酶消化，37℃作用 20min，期間振搖 2～3 次。

（4）棄去上清液，加入完全接種液終止消化，漂洗兩次。巴斯德吸管輕輕吹打至肉眼觀察無明顯的腦組織團塊，靜置 2min。

（5）懸液收集於新的離心管，離心（1000r/min，10 min，4℃），棄去上清液。加入完全培養液重懸，200 目不鏽鋼網過濾。根據實驗需要接種於若干個25cm細胞培養瓶或培養皿中。

（6）置 37℃、5%CO2培養箱培養24h後更換一次培養基，以後每3d換一次液，並在鏡下觀察細胞的生長和存活情況。

3、小膠質細胞的分離和純化

（1）細胞培養14～16d左右,在倒置相差顯微鏡下可觀察到混和膠質細胞培養物中出現細胞分層現象, 即底層為扁平、多種形狀的、具有多個突起的星型膠質細胞,小膠質細胞明顯偏小呈類圓形、折光性強,附著於星型膠質細胞表面生長。

（2）倒掉培養液,用0.05%胰酶2～3mL消化,邊觀察邊輕輕晃動培養瓶,等到貼附在星形膠質細胞上的小膠質細胞脫離下來,將含漂浮的小膠質細胞的消化液轉入10mL離心管，立刻用完全培養基終止消化。

（3）離心管配平,1000r/min, 離心5min, 棄上清；加定量完全培養再次吹打成細胞懸液,接種於預先包被的置有蓋玻片的24孔培養板,置於CO2恆溫細胞培養箱(37度)培養。

生長24h後吸掉培養液,以去除未貼壁的少突膠質細胞,加完全培養液繼續培養。

四、注意事項：

跟神經元取材一樣，一定注意撥除乾淨血管網；

小膠質細胞長多後再分離；

前期可以用神經元培養基培養兩天；

北京百歐博偉生物技術有限公司的中國微生物菌種查詢網提供微生物菌種保藏、測序、購買等服務,是中國微生物菌種保藏中心的服務平臺，並且是集微生物菌種、菌種,ATCC菌種、細胞、培養基為一體的大型微生物查詢類網站，自設設備及技術的微生物菌種保藏中心！歡迎廣大客戶來詢！

相關焦點

  • eLife|Aβ纖維引發的AD小鼠小膠質細胞的蛋白組變化和功能障礙
    令人驚訝的是，蛋白質組的動力學差異與Aβ纖維的存在有關，而不是營養不良的神經軸突，提示原纖維抗體可能觸發AD相關的小膠質細胞表型和觀察到的功能下降。鑑定出的AD小膠質蛋白質組學特徵為新型分子靶標的功能研究和監測AD進展或治療效果的潛在生物標誌物提供了參考。1.
  • 一種新型的小膠質細胞研究工具,為探索小膠質細胞開闢新途徑
    接下來，作者構建了HexbtdTomato小鼠用於監測小膠質細胞在體內的狀態，並證明了Hexb位點可被用於他莫昔芬（Tamoxifen）誘導Cre介導的小膠質細胞基因操作和小膠質細胞的譜系追蹤，且可排除CAMs的影響。　　總而言之，這篇文章提供了一種可用於特異性研究中樞神經系統中的小膠質細胞功能的新型工具。
  • 小膠質細胞在中樞神經系統創傷後的雙重作用及調控機制
    然而近期的一些研究發現小膠質細胞與循環中的單核細胞在很多不同。原基分布圖分析發現成年小膠質細胞來源於E8.5-9.0期間離開卵黃囊的原始胚胎祖細胞，經原始血流進入神經管。它們定位到CNS中，獲得了祖系特異的基因表達並分化為成熟小膠質細胞，小膠質細胞的發育依賴於Pu.1和Irf8轉錄因子，非骨髓來源的巨噬細胞所依賴的Myb和CSF1轉錄因子。
  • 人少突膠質前體細胞傳代過程中形態學的變化
    ：是中樞神經系統中除了星形膠質細胞、小膠質細胞和少突膠質細胞以外的第4種膠質細胞類型，形態呈典型雙極突起，特異性表達PDGFRα和NG2，廣泛分布於白質和灰質中，佔總細胞數的5%-8%。未成熟少突膠質細胞：為成熟少突膠質細胞的前一階段，細胞形態更為複雜，突起更多更長，部分突起出現分叉，但未交織成網狀結構，特異性表達O4、GaLC。背景：少突膠質前體細胞是治療腦白質損傷的種子細胞，建立高效穩定的體外培養方法是臨床應用的重要前提。
  • Nat Immunol:一種新型的小膠質細胞研究工具
    為了建立一種新的小膠質細胞基因靶向模型，作者首先應用大規模平行單細胞分析比較了小膠質細胞和CAM在穩態和疾病過程中的特徵，並發現己糖胺半乳糖苷酶亞基β（Hexb）可作為穩定表達的小膠質細胞核心基因，而其他小膠質細胞核心基因水平在病理過程中則表現出顯著下調。
  • 細胞原代培養——萬融實驗
    原代培養又稱初代培養，是指直接從機體內獲取組織或細胞，接種培養至第一次傳代階段。一般持續1～4周。原代培養的細胞有貼壁生長和懸浮生長兩種。貼壁培養是根據胰酶的消化原理，使細胞間的蛋白質水解，細胞離散，然後加入適量的培養液，置於合適的容器內，在一定的溫度下進行培養。
  • 科學家揭示小膠質細胞在視神經脊髓炎中的作用
    梅奧醫學中心神經內科系和神經科學系伍龍軍教授課題組主要研究小膠質細胞在神經系統功能中的正常生理功能以及小膠質細胞在神經系統疾病，如疼痛、癲癇、中風和自身免疫性神經病學中的病理作用。小膠質細胞是目前神經免疫研究的熱點，已經知道小膠質細胞在各種疾病過程中高度活化，然而，這種活化反應的功能在不同疾病中可能大不相同。
  • Nat Biotechnol:張素春等用多能幹細胞分化生成星形膠質細胞
    ，這項研究是由復旦大學上海醫學院解剖與組織胚胎學系*、著名幹細胞專家張素春教授與美國威斯康星大學麥迪遜分校經長達5年多的合作研究的，在一項幹細胞研究中，研究人員首次成功地利用人類多能幹細胞，分化生成了星形膠質細胞，該成果對腦組織、腦器官的再生、修復和腦部疾病治療有重要應用價值。
  • :張素春等成功誘導星形膠質細胞發生
    由復旦大學*、著名幹細胞專家張素春教授領導的研究團隊（來自美國威斯康星大學麥迪遜分校和復旦大學上海醫學院解剖與組織胚胎學系），近期在幹細胞研究中再次取得突破性成果，他們首次成功地利用人類多能幹細胞(hPSCs)分化生成了星形膠質細胞。
  • 關於人退變椎間盤細胞原代培養的一點體會
    關於人退變椎間盤細胞原代培養的一點體會 來源：丁香園論壇 2007-08-01 22:13 原代椎間盤細胞培養其實並不太難，但培養時間相對較長，所以容易出問題。
  • 診斷胼胝體發育不全有新方法!與星形膠質細胞有關
    使用小鼠和人腦掃描，由昆士蘭腦研究所副所長Linda Richards領銜的研究組發現，這些星形膠質細胞起初位於充滿纖維母細胞的下部區域，但隨著胎兒發育出一個分子信號路徑後，星形膠質便向前移動並成熟。這時，它們開始將自己編織起來，形成一個厚厚的圓柱，「坐落」在大腦的中央，並擠壓兩個半葉，引起之間的縫隙收縮。
  • Nature Reviews Neurosci:星形膠質細胞研究手段的最全總結!
    目前已有幾種星形膠質細胞轉錄和翻譯譜的相關研究，包括使用體外培養的星形膠質細胞分子圖譜進行早期評估、體內星形膠質細胞分子圖譜的選擇性基因靶向研究、以及單細胞水平星形膠質細胞的分子特徵。這部分研究需要注意的是：首先，研究星形膠質細胞的必要步驟是純化細胞，且不在此過程中引入分子改變，體內星形膠質細胞的完整轉錄情況可能無法通過純化的星形膠質細胞體現，從而影響後續分析。
  • 陳根：小膠質細胞與老年痴呆，治療之路在何方？
    小膠質細胞在對抗阿爾茨海默症中顯得尤為重要，這或將給阿爾茨海默症的研究提供了新的轉機。當神經元受到各種不利因素影響時，小膠質細胞作為中樞神經系統中最初的免疫反應，轉移至受損部位，產生作用。在這個過程中，研究人員又意外發現了小膠質細胞的身影。
  • 《科學》子刊:飲酒會導致小膠質細胞吞噬和修剪突觸,引發焦慮
    與酒精成癮的神經免疫假說相一致的是，敲除多個參與免疫反應的基因可減少小鼠的自願酒精攝入；在大腦中，這些基因僅在小膠質細胞中表達或高度富集。 相反，他們的數據更符合之前的多項轉錄組學研究，尤其是一項RNA測序研究：來自小鼠前額葉皮層的小膠質細胞長期暴露於酒精（使用隔日兩瓶的選擇模式）不會誘發典型的促炎性細胞因子表達特徵。
  • 「吞噬記憶」的小膠質細胞 或讓記憶調控有跡可循
    記憶信息被編碼於一些神經元中，我們將之稱為記憶印跡細胞。然而，記憶究竟如何隨時間消退，一直讓人捉摸不透。  　　經過3年多的努力，浙江大學醫學院谷巖研究員課題組和王朗副研究員課題組首次發現，用於免疫的小膠質細胞通過清除突觸而引起記憶遺忘，並進一步發現補體信號通路參與了小膠質細胞介導的遺忘。該研究發表於國際頂級期刊《科學》上。
  • 「吞噬記憶」的小膠質細胞或讓記憶調控有跡可循
    王朗笑稱，揭開印跡細胞的激活率下降的謎團，我們決定從它開始「破案」』。課題組將清除小膠質細胞的小鼠進行了記憶的形成和提取等一系列的實驗後，發現印跡細胞的重新激活率下降的現象得到抑制，對記憶遺忘的抑制作用非常顯著。「去除小膠質細胞的小鼠的恐懼反應要比對照組更加明顯，處於靜止狀態的時間是對照小鼠的2倍多。」谷巖說。圖2. 清除小膠質細胞抑制了遺忘。
  • 多篇文章聚焦科學家們近年來在星形膠質細胞研究上的新進展!
    相反，他們的數據更符合之前的多項轉錄組學研究，尤其是一項RNA測序研究：來自小鼠前額葉皮層的小膠質細胞長期暴露於酒精（使用隔日兩瓶的選擇模式）不會誘發典型的促炎性細胞因子表達特徵。同樣，在這些作者開發的乙醇暴露模型中，TLR4的轉錄表達明顯下降，這與之前的一項表明體外培養的人外周血單核細胞急性暴露於酒精可抑制TLR4信號轉導的研究更為一致。
  • 實驗過程中遇到的不增殖細胞有哪些?
    細胞系可無限傳代，但是由於其本身傳代的次數過多，往往容易使得細胞的活性狀態就降低了，無法保證細胞在這樣的狀態下呈現的數據是否準確，所以對後期一系列的實驗都會產生不同程度的影響。原代細胞是通常是從人或動物組織中進行提取分離培養的，雖然活性狀態保持了，但是由於在培養過程中，由於不同種屬、分離方法及培養條件等因素的影響，細胞培養到一定程度，生長就會出現停滯，開始出現老化甚至死亡，細胞數量上卻無法滿足實驗的需求。
  • 解讀BRAIN亮點文章︱復旦華山醫院崔梅/董強合作報告小膠質細胞外...
    小膠質細胞是大腦中的主要吞噬細胞，已被證實是神經炎症的誘因之一，且特別是激活狀態的小膠質細胞會產生大量的神經炎症因子，包括TNF-α、IL-1β及IL-6等【4】。因此，深入探究小膠質細胞（microglia）是如何調節αSyn的聚集和擴散的，對於進一步理解PD機制是至關重要的。總之，小膠質細胞是如何影響αSyn病理？以及多大程度上影響了αSyn病理？目前還沒有一個確切的定論。
  • 「實驗」細胞傳代培養
    移液器2.熟悉細胞培養過程中的無菌操作技術。3.掌握細胞傳代培養的基本方法。4.掌握貼壁生長細胞的一般形態和生長狀態。2、細胞培養技術的優點由於人工培養條件易於改變並能嚴格控制和能進行單因素分析，所以便於用各種物理的、化學的或生物的外界因素來研究細胞生命活動的規律；由於細胞處於體外培養環境中，便於用各種技術方法研究和觀察細胞結構和功能的變化；由於細胞在體外培養環境中可以長期地存活和傳代，因而便於研究和觀察細胞遺傳性的改變；可以比較經濟地、大量地提供生物性狀相同的細胞作為研究對象。