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作者：黨圓圓，張洪鈿，徐如祥，陸軍總醫院附屬八一腦科醫院
一、神經炎症反應與小膠質細胞概述
神經炎症反應是許多神經退行性病變的重要病理基礎，在神經系統創傷後的神經退變中也發揮重要作用。作為CNS固有免疫反應的主要介質，小膠質細胞在神經炎症及神經創傷後的二次損傷中發揮重要作用。近年來，人們認識到小膠質細胞在腦和脊髓創傷後具有雙重作用，一方面促進組織恢復，另一方面導致神經退變。
小膠質細胞通過吞噬作用清除細胞碎片，並釋放神經生長及抗炎因子而減輕神經損傷，促進組織修復。然而很明顯，小膠質細胞高度活化狀態可釋放高水平的促炎因子及細胞毒性物質，從而造成神經元失能及細胞死亡。神經系統損傷後，活化的小膠質細胞及浸潤的巨噬細胞具有異質性。大體可分為促炎的M1型細胞及具有免疫抑制作用的M2型細胞。關於這種「M1/M2」範式的研究越來越多，其目的都是探討小膠質細胞的雙重作用並研究其調控機制。
二、小膠質細胞在正常神經系統中的來源和功能
小膠質細胞佔成人神經系統細胞總數的十分之一，是腦和脊髓固有免疫系統的主要組成成分。其一直被視為神經系統內的巨噬細胞。然而近期的一些研究發現小膠質細胞與循環中的單核細胞在很多不同。原基分布圖分析發現成年小膠質細胞來源於E8.5-9.0期間離開卵黃囊的原始胚胎祖細胞，經原始血流進入神經管。它們定位到CNS中，獲得了祖系特異的基因表達並分化為成熟小膠質細胞，小膠質細胞的發育依賴於Pu.1和Irf8轉錄因子，非骨髓來源的巨噬細胞所依賴的Myb和CSF1轉錄因子。另外，小膠質細胞受CSF-1受體（CSF-1R）及IL34調節，最近轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGFβ）也被確定是一個關鍵的分化因子，從E14.5開始發揮作用。在一生中卵黃囊來源的小膠質細胞與循環血中的單核細胞各自獨立，小膠質細胞在健康CNS中可以自我更新保持一定數量，可能來源於CNS中的祖細胞小膠質和腦內巨噬細胞表達許多尋常的蛋白標記物如CD11b和CX3CR1，然而最近的轉錄組學分析發現小膠質細胞具有獨特的分子信號。
與循環血中的單核細胞及其他發源於原始卵黃囊的位於特定組織中的巨噬細胞均不同。這種小膠質細胞特異性的基因簇，包括p2yr12、Tmem119、Tgfbr1、Fcrls、Offml3等，現已被用來精確地鑑別小膠質細胞與巨噬細胞及單核細胞。直至不久前人們仍認為正常大腦中的多分枝的小膠質細胞是靜息且無活力的，但更精準的在體成像學研究表明小膠質細胞具有高度的活性，其不斷地重複伸展、回撤和重新構造的循環，隨時監視其周圍環境內穩態的破壞。這種生理學特性使小膠質細胞能巡視腦部微環境並清除蓄積的代謝產物或細胞吞噬後的組織碎片。不僅是維持CNS內穩態，小膠質細胞還具有調節細胞死亡，突觸清除、神經再生及神經元監視等活性，從而在神經系統發育，突觸可塑性及成年個體的學習能力等起重要作用。這樣，最新研究表明小膠質細胞改善神經環路及連接，有助於神經可塑性。所以除了在CNS損傷與疾病中的應答，小膠質細胞在正常神經系統的塑造方面也扮演著積極的角色。
正常神經系統中，小膠質細胞清除細胞碎片，但不會改變其分枝狀的表型。與此相對的是在損傷或感染應答中，小膠質細胞活化而在形態及基因表達上明顯改變。與外周細胞相似，小膠質細胞表達病原體識別受體如Toll樣受體和Nod樣受體，然後對病原體相關的分子模式及損傷相關的分子模式（damage associated molecular patterns，DAMPs）產生應答。後兩者是CNS中神經元及其他細胞損傷的產物。它們還表達損傷後神經元釋放的一系列其他受體，包括腺苷三磷酸、穀氨酸鹽、生長因子及細胞因子。小膠質細胞是抗原遞呈細胞，與T淋巴細胞相溝通，一經活化則上調細胞表面標記物如MHCⅡ及CD86，以及黏附分子和補體受體。將小膠質細胞維持在正常生理狀態的關鍵是CNS的免疫抑制效應。
在正常大腦中神經元表達大量免疫抑制蛋白，起著「關」信號的作用，與特殊小膠質細胞受體配對以維持其非活化狀態。這種神經元-小膠質信號機制包括曲動蛋白-CX3CR1，CD47-CD172a/SIRPα，CD200-CD200R1等。另外，神經元、星形膠質細胞及小膠質細胞在局部釋放的可溶性因子如神經營養因子，抗炎性細胞因子及前列腺素等也促使小膠質小細胞保持一種「監視」狀態。
三、小膠質細胞的活化
目前已知小膠質細胞在神經系統中的活化有明顯的異質性。巨噬細胞在非神經組織有顯著地可塑性，可使它們在暴露於病原體及組織損傷時能有效地對環境信號做出應對並改變其表型及功能。這一過程稱為巨噬細胞極化，是固有免疫中的適應性反應。巨噬細胞有兩種明顯的極化狀態，稱為M1及M2，分別代表著巨噬細胞功能性活化譜系的兩端。這個活化譜系中包括1個M1及3個M2極化亞型，即M2a，M2b和M2c，其各有相應獨特的功能及表型標誌物。小膠質細胞的多重活化表型是一個相對較新的概念，而我們不能假定外周巨噬細胞的表型及功能可以直接套用到CNS中的小膠質細胞中。實際上，最近研究指出刺激導致的小膠質細胞的轉錄適應性與巨噬細胞的M1或M2適應性並不一致。然而儘管它們在個體發生學上有所不同，小膠質細胞仍有極化為「M1樣」和「M2樣」活化表型的能力，而它們在神經系統損傷及修復過程中的作用尚未被充分認清。
小膠質細胞與巨噬細胞對促炎分子如細菌脂多糖（lipopoly saccharides，LPS）或TH1細胞因子，幹擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）發生反應，形成經典的M1樣表型，從而產生高水平的促炎細胞因子（IL-1β，IL-12，TNF-α），趨化因子（CCL2，CXCL9，CXCL10）以及活性氧（reactive oxygen species，ROS），這些是宿主防禦的要素。M1樣表型標誌物包括CD16、CD32、CD86、iNOS和MHCII，M1樣活化與細胞吞噬、鐵限制所致的病原體殺傷力、吞噬體酸化及ROS釋放有關。許多例子中，M1樣反應具有保護性，且會在損傷或病原體清除後而下調；但失控的或過度的M1樣活化可以通過促炎因子及神經毒性介質的釋放造成細胞毒性，這些毒性介質能引發小膠質細胞介導的神經退變惡性循環。
而輔助性T2（helper T cell，Th2）細胞因子如IL4和IL13刺激小膠質細胞及巨噬細胞可誘發「替代性的」M2a樣改變，它與寄生蟲免疫、T2細胞募集、組織修復和生長刺激有關。M2a極化型細胞除可產生抗炎細胞因子（IL10）外，還上調多種表型標誌物如CD206，arginase1，Ym1，Fizz1，抑制NFκB異構體並增加清道夫受體以加強吞噬作用。小膠質/巨噬細胞在IL-10、糖皮質激素存在時或吞噬了凋亡細胞後，還會採納一種「去活化」的M2c樣表型，該表型在炎症反應下調後可幫助組織重塑和基質沉積。M2c極化細胞上調等的表型標誌物包括CD163、CD206、Sphk-1及TGF-β。最後，小膠質/巨噬細胞在暴露於免疫複合體及TLR配體時還會採納一種中間化的M2b樣亞型，M2b具有促、抗炎雙重作用，且與記憶免疫反應（B細胞轉化補充為Treg細胞）有關。M2b表型兼具M1（CD86、MHCⅡ），和M2（IL-10high，IL-12low）細胞的特點。
T細胞受M2b巨噬細胞刺激後偏向Th2反應，這說明M2b可能是M2反應的整體調節者。各極化狀態的表型標記物已在體外模型系統中確定，而體內實驗中定義特異性標誌物難度更大，需要不同的環境及組織特異性刺激來驅動極化。在神經系統損傷或神經退行性病變中小膠質細胞及浸潤的巨噬細胞通常表現為混合表型，這表明其天然的可塑性及在應對局部環境信號及炎症環境變化時產生複合活化表型的能力。很明顯，M1-M2範式是一個過於簡單化的模型，它只描述了活化狀態的兩級，然而僅根據有關神經系統創傷小膠質/巨噬細胞亞型的有限資料，這種M1樣與M2樣的分類法已經為探究局部小膠質及浸潤的巨噬細胞的損傷-保護雙重作用，以及探索新治療策略確立了一種研究框架。
四、創傷性腦和脊髓損傷後的免疫反應
CNS損傷後數分鐘內就出現強烈的神經炎症反應。它由複雜的分子及細胞炎症反應過程所介導。為研究這些事件的時間輪廓，人們採取了動物模型、人類手術活檢、屍體解剖標本以及患者血清及腦脊液標本。無論是否穿通傷，各種類型的損傷均會在核心區造成瞬時細胞死亡（原發傷），破壞後的細胞釋放DAMPs，通過模式識別受體向其他局部及浸潤的免疫細胞釋放信號，損傷處星形膠質細胞、小膠質細胞及受損的神經元分泌細胞因子及化學因子。這些免疫介質活化了損傷處的小膠質細胞及星形膠質細胞，並經損傷急性期破壞的血腦屏障募集外周免疫細胞。中性粒細胞是CNS後最早聚集於腦或脊髓的外周細胞，它們試圖通過吞噬作用清除細胞碎片。然而中性粒細胞還因釋放毒性介質如ROS而造成進一步組織損傷，實驗發現TBI後的中性粒細胞浸潤在損傷後1d達到高峰，隨後各種白細胞類型在損傷後3d達到高峰。
單核細胞在局部化學因子（CCL2、CCL5及CXCL10）促進下聚集於受損神經組織，一旦進入腦它們便分化為巨噬細胞。目前根據其表面表達的化學因子受體CCR2和CX2CR1將單核細胞分為兩個亞群：CCR2+細胞代表「炎症」單核細胞（CD11b+CD45hiCCR2+Ly6Chi），而CX3CR1細胞代表「巡邏」單核細胞（CD11b+CD45hiCX3CR1+）。其中炎症單核細胞被優先募集於CNS損傷。它們在損傷後3d的損傷區佔主導地位。樹突狀細胞（dendritic cells，DCs）、T淋巴細胞及NK細胞也在此時期被募集，但相比單核細胞其數目甚少。DCs及T細胞在TBI後的病理生理功能尚未確知，但T細胞的不同亞型確實能調解局部免疫反應向加重或保護方向發展。在此時間框架中腦局部膠質細胞高度活化。
損傷區周邊星形細胞激活並上調膠質纖維酸性蛋白，產生細胞因子及化學因子，從而造成更多的局部小膠質細胞及外周免疫細胞的活化和募集。小膠質細胞活化後從多分枝狀轉化為變形蟲樣，其形態上與募集外周血的巨噬細胞無法區分。它們分泌促炎細胞因子及自由基，產生神經元毒性並造成損傷後神經退變。這樣，CNS損傷後的炎症反應就十分複雜，許多相關分子及細胞事件參與其中，促進局部小膠質細胞、星形細胞活化，招募外周免疫細胞，破壞神經元。在這種複雜的組織損傷環境中確認M1和M2樣小膠質及巨噬細胞的貢獻及功能作用絕非易事，值得高興的是，一些相關的關於表型反應的實驗研究已經開始。
五、CNS損傷後的M1與M2樣反應
M1與M2樣小膠質/巨噬細胞理應共同作用實現一種配合默契的免疫反應，清除細胞碎片，促進修復及組織重建。從而使創傷成功癒合，促進損傷後內穩態形成。然而臨床及實驗研究均表明慢性持續性的M1樣表型可在一次中等水平或重複輕度TBI後持續數月至數年之久，而僅有非常有限的組織修復功能，特別是在中重度損傷後。脊髓損傷和缺血性腦損傷的實驗研究表明，在損傷處，大多數小膠質細胞及募集的巨噬細胞具有M1樣及M2樣混合表型。但M2樣反應是暫時性的，在損傷後1周左右主導表型即向M1樣遷移。損傷處佔主導的M1樣細胞吞噬活性降低，分泌促炎及神經元毒性介質的能力提高，從而加劇損傷。而且，M1樣巨噬細胞可能通過上調一種抑制軸突再生的硫酸軟骨素蛋白多糖而損傷軸突重建機制。類似的M1、M1樣活化動力學適用於TBI，控制性皮層撞擊損傷（controlled corticalim pact injury，CCI）造成的局部腦挫傷造成局部組織廣泛破壞，小膠質活化（CD11b+/CD45low），同時，在損傷後24h內，強勁而迅速的中性粒細胞（CD11b+/CD45+/Ly6G+）和炎症性單核細胞（CD11b+/CD45hi/CCR2+/Ly6Chi）會浸潤到損傷皮層。
使用流式細胞術分析M1及M2樣活化表型標誌物可發現小膠質細胞活化反應的雙峰模式，在損傷後7d為第1個峰，以CD206+/CD45low/CD11b+的M2樣活化為特點，而在損傷後28d則是以CD86+/CD45low/CD11b+的M1樣活化為特點的第2個高峰。組織學研究結果證實了這種時相變化，暫時性的CD206+M2樣活化作用在CCI後5d達到高峰，而後轉變為以CD16/32+M1樣活化作用為主的階段，並伴隨白質損傷這些資料表明在CCI急性和慢性期小膠質細胞和/或巨噬細胞的活化亞型是不同的。最近利用轉基因小鼠模型的藥理研究為局部小膠質細胞與浸潤的單核細胞對CNS損傷後M1/M2樣極化作用貢獻的比較提供了重要信息。Morganti等使用CX3CR1GFP/+CCR2RFP/+報告基因的小鼠，用來研究TBI所致的CCR2+單核細胞在腦中聚集的時間動力學。由於小膠質細胞在靜息或CNS損傷後都不表達CCR2，故該模型可以明確區分外周炎性單核細胞（CCR2RFP/+）和局部小膠質細胞（CX3CR1GFP/+）。CCl2是CCR2的同源配體，根據外科切除標本、TBI患者腦脊液檢測結果，發現其表達在腦外傷後數小時明顯上調，動物實驗結果也與此相符。
使用基因敲除小鼠評估TBI後CCL2/CCR2信號的功能效應發現，CCL2或CCR2缺失會改善神經功能及病理學轉歸。與野生型小鼠相比，CCL2-/-小鼠經受閉合顱腦損傷後神經功能保留較好，病灶較小，星形細胞與F4/80+巨噬細胞聚集也較少。同樣的，CCL2-/-小鼠較野生型對照組在經受CCI後損傷範圍減小，促炎基因表達降低，損傷皮層處巨噬細胞（CD45hiCCR2+andF4/80+cells）浸潤減少。該模型在損傷後8周後還可見小鼠在水迷宮測試中的認知表現的提高及海馬神經退變的減輕。使用CCR2拮抗劑同樣可改善實驗性TBI的預後。當給重力砸傷TBI大鼠高劑量CCR2抑制劑RS504393後，其早期細胞凋亡減輕，水迷宮認知功能測試結果改善。最近Morganti等使用CX3CR1GFP/+CCR2RFP/+小鼠的CCI模型評估了一種新的CCR2拮抗劑（CCX872），表明預先給予該試劑可減少CCI後巨噬細胞（CD45hiCCR2+F4/80+cells）的快速聚集CCR2拮抗劑還能促進TBI後認知功能恢復，預先給予CCX872的小鼠在損傷後28d的放射臂水迷宮的表現有所提高。該團隊還發現CCR2+巨噬細胞在CCI後浸潤大腦，相繼表達M1標誌物，而後為M2a，最後為M2c標誌物。
這種CCI後腦內CCR2+巨噬細胞的M1/M2樣活化反應與CNS以外的創傷修復巨噬細胞的破壞性反應類似，具有促炎和蛋白水解作用的巨噬細胞在損傷後迅速積聚，隨後產生具有創傷癒合功能及抗炎作用的巨噬細胞然而，在TBI聚集的CCR2+巨噬細胞最終體現為上調了促炎的M1樣細胞，使其在晚期發揮神經毒性。而CCR2拮抗物明顯減輕了這種促炎過程並能改善長期功能預後。Hsieh等的一個研究也很有趣，他們使用一個帶有M2型巨噬細胞（eYFP arginase 1；YARG）報告基因的小鼠模型，用來觀測CCI後浸潤的巨噬細胞亞型的作用，並發現浸潤損傷組織的Arg+巨噬細胞至少還分化成兩種亞型，且表達著不同的趨化因子。對TBI後浸潤到腦組織的Arg+和Arg-巨噬細胞各亞型的基因表達分析表明它們並不能區分為真正的M1或M2樣轉錄模式，而是採取了複合的分子表型，而隨著損傷後時間推移，巨噬細胞亞型的比例也在變化。上述最後兩個研究強調了TBI後巨噬細胞反應的可塑性，並指出損傷局部微環境中刺激因素的變化是如何使其表型與功能發生變化的。現有的多數關於CNS損傷後M1/M2樣亞型的研究均採用了有明顯組織破壞/缺損及大量細胞滲透的局部TBI模型，另有少數為脊髓損傷模型。
了解到這一特點很重要。另外，如中線液壓打擊腦損傷（mFPI）這樣的瀰漫性神經損傷模型也能夠造成慢性小膠質細胞活化，其具有M1樣特點但無明顯巨噬細胞浸潤成分。瀰漫性腦損傷後約4hIL-1β和TNFα在皮層及海馬短暫增加，72h後回歸基線，與假手術組相比，損傷組大量小膠質細胞與損傷後24h表達M1樣標誌物（IL-1β，iNOS，CD14）及M2標誌物（arginase1）。在30d後的慢性期單個小膠質細胞的MHCⅡ表達還有增加，這種「致敏」的表型可造成對二次免疫打擊如LPS的過度炎症反應，該作用自數周持續到數月，並與抑鬱樣行為相關。
在瀰漫性腦損傷後，皮層與海馬小膠質細胞的形態有微妙變化，一個研究發現mFPI後大鼠S1BF區的小膠質細胞出現一種棍棒樣形態並延軸索呈列車樣排列，這些細胞參與DBI後環路重建，但尚未明確它們屬於傷害性（M1樣）還是有益的（M2樣）反應。有趣的是，棍棒樣小膠質細胞在體外模型系統中具有神經保護作用。其他影響M1/M2極化的因素包括損傷程度，位置主要是在白質還是灰質，以及年齡。缺血性損傷模型表明，缺血核心區小膠質/巨噬細胞的表型與缺血半暗帶的表型不同。例如，M2樣標誌物Ym1與CD206僅在核心區的變形蟲樣細胞表達，而CD16/32（M1樣標誌物）除表達於上述細胞外，還表達於缺血半暗帶內分枝狀的細胞內。有趣的是，Ym1在局灶TBI中表達還有區別，它高表達於皮層挫傷區內不表達CD68的變形蟲樣細胞中，但也表達於皮層下區的分枝狀細胞中。另外小膠質細胞表型隨組織類型而變化，與灰質相比，白質中的小膠質細胞從M2到M1的表型轉化更加迅速。所以，損傷強度及部位明顯影響CNS損傷後小膠質細胞形態及表型的變化。
不同程度、不同損傷模型及區域的小膠質細胞的功能仍待進一步研究（如：局灶與瀰漫性損傷的對比）。隨年齡增加，小膠質細胞形成一種高度炎症化或致敏狀態，致敏小膠質細胞的炎症標誌物和介質的表達基線上調，活化及形成促炎（M1樣）狀態的閾值降低，對免疫刺激後的炎症反應擴大。小膠質在老年腦中致敏可造成認知障礙，突觸可塑性下降及神經退變加速。許多關於老年腦小膠質細胞表型變化的研究證實年齡增高整體造成促炎（M1樣）基因表達增加，替代（M2樣）基因表達減少.然而最近一項應用直接RNA測序的研究發現老年腦中致敏小膠質是M2極性的，高齡使小膠質表型偏向於神經保護狀態。
有趣的是，從早期與晚期AD患者屍體解剖的前額葉與小腦標本的表型研究發現，早期AD標本表型向M1偏斜，而晚期則向M2a偏斜。由於結論不一，且腦內小膠質表型與功能作用的分析具有複雜性，判斷年齡對CNS損傷及退行性變中小膠質細胞表型的作用仍需進一步研究。儘管如此，當老年小鼠（24個月）遭受CCI後，它們與年輕小鼠（3個月）相比會在大腦皮層及海馬產生更加強烈的神經炎症反應，這與神經退變及較差的預後有關。高齡小鼠小膠質細胞向局造型雷射損傷遷移的速度更慢，而在損傷灶停留的時間延長。在表型上，高齡TBI小鼠M1樣基因表達（IL-1β，iNOS，TNF）明顯增加，M2樣基因表達則似乎失控：許多M2樣基因明顯上調（arginase1，Ym1），其他則下調（Fizz-1，TGFβ，IL-4Rα）。IL-4Rα和TGFβ表達的減弱提示高齡的小膠質細胞M2樣表型調節受損，其抗炎通路的反饋敏感性下降。這點被其他研究所支持，如老年小膠質細胞在LPS注射或單純脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）後的不能上調IL-4Rα，由此使老年小鼠中依賴於IL-4的生成M2a樣或促修復的小膠質細胞表型的程序的敏感性降低。
六、CNS修復和再生中小膠質/巨噬細胞不同表型的角色和作用
大量體內和體外實驗表明M2極化的小膠質細胞和巨噬細胞具有促進表型特異性CNS修復和再生的作用。所以，更好的理解調節TBI後小膠質/巨噬細胞功能反應的分子機制可以幫助我們找到旨在調節TBI後細胞表型從而改善功能的治療手段。以下部分我們回顧小膠質細胞/巨噬細胞活化表型的改變是如何影響CNS修復與再生的各個過程的。
1.神經再生
在成年哺乳動物中樞神經系統再生主要發生於海馬結構中齒狀回的顆粒下層（subgranular zone，SGZ）及前腦的側腦室室下區（subventricular zone，SVZ）。分枝狀小膠質細胞是成年動物海馬顆粒下層神經區位的主要成分，通過分泌促神經再生的可溶性因子引導神經幹/祖細胞（neural stem cells，NSC）的遷移和分化。腦損傷不僅可誘導成年動物SVZ和SGZ的內源性神經生長，也可誘導非神經生長區如臨近損傷的紋狀體和皮層的神經生長。然而只有一小部分新生神經元可長期存活，而這主要取決於新生神經元所遭遇的病理環境。神經炎症反應是病理環境的關鍵成分，相關細胞的活化狀態可決定創傷後神經炎症利於或不利於神經再生如，LPS誘發的炎症使成年大鼠小膠質細胞呈明顯的M1樣活化屬性，嚴重損傷海馬的基線神經再生水平，而給予抗炎藥物如吲哚美辛或米諾環素後這種再生水平可獲恢復。
進一步地，體外試驗中LPS刺激後的小膠質細胞或其條件培養基可減少NSC存活並使其不能分化。更多的研究表明M1樣小膠質/巨噬細胞產生多種促炎細胞因子，如IFNγ，IL-1β，TNFα，和IL-6，可抑制神經再生。相對的，在共培養系統中，IL-4刺激小膠質細胞後，使其轉向M2樣表型，可促進NSCs的神經再生。這種作用是通過提高胰島素樣生長因子1（insulin-like growth factors-1，IGF-1）水平實現的，後者是一種與海馬增殖及神經元生長有關的細胞因子。小膠質細胞利於成年動物神經生長的作用在許多研究中得到支持，包括NSCs與小膠質細胞共培養，或生長於包含神經營養因子如鹼性成纖維生長因子腦源性神經營養因子，神經生長因子等的小膠質細胞條件培養基的體外實驗。例如，小膠質細胞和小膠質細胞條件培養基可維持體外培養的源於SVZNSCs的成神經細胞的構造，否則將因連續培養而喪失。所以，小膠質細胞釋放的上述以及其他一些保護性因子（如絲氨酸蛋白酶2）有利於神經祖細胞增殖，成纖維細胞的遷移及將新生神經元整合進成年動物海馬SGZ的過程。
TBI增加了NSC在局灶性和瀰漫性損傷模型中NSC的增殖比例，而並不增加成年海馬的神經生長，另外，TBI促進膠質細胞（星形細胞和小膠質細胞）增殖，這一過程在慢性期十分活躍。這些研究表明TBI在促進NSC增殖的同時活化了腦內固有的修復反應和/或重塑機制。然而，長時間的上調促炎通路會抑制新生神經元向對應區域的功能整合，故而為了成功修復CNS損傷，有必要對內源性神經生長過程給予額外的支持/幹預。實際上，許多增加內源性神經再生的治療方法都可改善成年嚙齒類的TBI預後，如TBI損傷區條件性IGF-1過表達可造成SGZ未成熟神經元密度在CCI後10d明顯增加，最終改善了認知功能恢復。說明IGF-1在神經再生中有重要作用，有趣的是，CCI小鼠在慢性期使用籠內滾輪進行了主動運動練習後，M1樣小膠質細胞活化明顯減低，而海馬中IL-10、環磷腺苷效應元件結合蛋白、腦原性神經營養因子和IGF-1水平明顯增高，促使SGZ神經再生得到增強，慢性期的認知功能恢復水平得到提高。
2.血管生成
成年CNS脈管系統在生理狀態下非常穩定，但在損傷後則活化。成年血管重塑包括成熟內皮細胞的血管生成和內皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）的血管發生。EPCs位於骨髓和外周血中，在CNS損傷後在血液中動員並在神經組織中積聚，許多能增加血管生成的藥物均能改善實驗性TBI或SCI的功能預後。在損傷的腦內血管重塑發生於腦缺血性損傷後數天內的缺血半暗帶中，新生血管通常被小膠質就巨噬細胞所包繞，表明活化的小膠質/巨噬細胞可能有利於促進腦缺血後血管新生反應。儘管小膠質細胞在創傷後血管生成和血管修復過程中的表型特異性尚未可知，但已知M2樣巨噬細胞對血管修復和創傷癒合起到了關鍵作用。M2型巨噬細胞通過產生促血管生成因子及生長因子如血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、成纖維生長因子-2（fibroblast growth factor-2，FGF-2）等促進血管生成，兩種因子的促血管生成作用均為劑量依賴性，在體外研究中表現出協同作用，他們誘發內皮細胞增殖和遷移及血管發芽。
最近研究揭示了血管生成能力增高的分子機制，M2樣巨噬細胞通過下調金屬蛋白酶組織抑制劑而釋放機制金屬蛋白酶9前肽（proMMP9），從而在複雜的病理微環境下促使血管生成及脈管系統修復。重要的是，實驗性TBI後促血管生成因子（VEGF和FGF）的過表達具有神經保護作用，可增加創傷後血管生成及神經生長從而改善功能恢復。神經系統內皮細胞增生是血管生成的早期步驟。小膠質細胞的活化狀態可通過調節M1樣細胞因子TNF-α和M2樣細胞因子TGFβ的平衡而調控上述過程。此外在體外實驗中，將二甲雙胍極化的M2型小膠質細胞的條件培養基處理腦血管內皮細胞，可促進血管生成。而且，長時間二甲雙胍治療的大腦中動脈閉塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）小鼠可增強小膠質/巨噬細胞的M2極化作用，增加血管生成及神經生長，最終改善功能預後。總而言之，體內外實驗均提示M2極化的小膠質細胞和巨噬細胞在創傷後血管生成及修復過程中起支持作用。
3.少突膠質細胞生長與髓鞘再生
近期研究表明M2極化的小膠質細胞和巨噬細胞對CNS損傷後有效的髓鞘再生必不可少。實驗性多發性硬化後自身免疫性腦脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）中，在疾病的脫髓鞘階段有一個從M1到M2顯性表型的轉變。而復發階段的特點是M1反應為主而具有免疫調節作用的M2極化作用受到抑制。表型還可調節少突膠質細胞的分化，在體外試驗中，M2極化的小膠質細胞的條件培養基可以促進前體細胞分化成成熟的少突膠質細胞。而當EAE小鼠M2極化細胞減少時少突膠質細胞的分化明顯減少。這些數據表明M2極化小膠質/巨噬細胞通過驅動少突膠質細胞分化促進CNS髓鞘再生。此外還有更多的的研究支持這些結論並表明小膠質/巨噬細胞表型影響少突膠質細胞的存活。Wang等在一個缺血缺氧的體外模型中發現M1極化的小膠質細胞的條件培養基加劇了糖氧剝奪（oxygen glucose deprivation，OGD）引發的小膠質細胞死亡。而M2條件培養基則在OGD後對少突膠質細胞的存活力起保護作用。
炎症同樣影響成人CNS少突膠質細胞，如M1極化的小膠質細胞通過一種依賴TNFα的機制阻斷了少突膠質細胞再生,而M2極化的小膠質細胞則沒有這種阻斷作用，並通過釋放IGF-1等作用促進少突膠質細胞形成。綜上，最近的研究提示小膠質細胞和巨噬細胞的極化對CNS損傷後少突膠質細胞存活與髓鞘再生具有重要作用。
七、調整M1/M2樣表型從而改善CNS創傷後預後的策略及實踐
如前所述CNS損傷後局部微環境對小膠質細胞和巨噬細胞的極化狀態有關鍵影響。損傷局部生化環境所產生的細胞外信號驅動表型的轉移和細胞功能反應。例如，當在小膠質培養環境中加入缺血神經元的條件性培養基，小膠質細胞即採納M1樣表型，促炎介質（TNFα，NO）產生增多，抑制小膠質吞噬作用，這說明損傷神經元釋放了驅動M2向M1表型轉移的可溶性因子。損傷微環境中有很多可溶性因子如TNFα，IFNγ和脂質運載蛋白2，可促使M2向M1轉移。T細胞亞型同樣會滲透入損傷區域而釋放受T細胞來源的因子，驅動CNS損傷後小膠質/巨噬細胞表型變化，此外，信號通路的複雜網絡，轉錄因子，表觀機制及轉錄後調節都在控制著小膠質/巨噬細胞極化，包括IRF/STAT/SOCS信號通路，NFκB活化，核受體（RXR，PPARγ,PPARδ）氧化還原信號（Nrf2，HIF-1α，NOX2），組蛋白脫甲基酶及小RNA（miR；miR-155/miR-124）以及其他。這樣，損傷微環境的細胞外信號及細胞內分子機制均調控小膠質細胞和巨噬細胞的表型轉移。
以損傷灶微環境的因子或細胞內傳導通路為目標的治療觀點也許能動態地改變TBI後小膠質/巨噬細胞的表型和功能反應，形成新的治療方法。針對TBI已有以細胞為基礎的治療，因M2樣小膠質/巨噬細胞具有抗炎作用且能促進神經再生與修復，故移植M2極化細胞以抵消M2向M1轉移的趨勢也許是一種不錯的減輕神經退變和促進長期功能恢復的策略。這種途徑在CNS損傷模型中的嘗試結果不一，一項研究採取將M2巨噬細胞移植入SCI後的成年大鼠的方法，結果炎症屬性從M1主導變為M2主導，並產生抗炎因子（IL-10，TFGβ），後者反過來創造出局部微環境，利於殘存髓鞘及神經元的救援，並保護了運動功能。然而，在腦缺血研究中，儘管體外模型效果明顯，在MCAO後3d將M2型巨噬細胞移植入大鼠腦缺血灶未在能改善損傷後2周時的組織及功能學預後。
至今為止，將M2巨噬細胞移植入TBI模型的效果尚未有人評估，然而，將人骨髓間充質幹細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，MSC）移植入TBI小鼠後可促進強勢的M2樣極化並改變損傷微環境，結果M2介導的修復反應加強，晚期神經功能恢復改善。這些作用部分由STAT3/NFκB信號介導，因為MSC是通過活化STAT3和抑制NFκB通路而誘導巨噬細胞M2極性反應的。儘管在實驗模型中的發現令人鼓舞，我們仍不知道具有可塑性的M2極化細胞在移植入反應性損傷環境後如何反應，該環境中可能包含大量細胞外信號，從而改變或降低免疫抑制反應和損傷修復所必須的M2樣特性。
CNS損傷後使用細胞轉移策略究竟能怎樣促進M2介導的神經保護與修復還需進一步研究。許多藥物被證明可改變小膠質細胞與巨噬細胞的M1/M2樣平衡，且能有效治療CNS損傷。核激素受體PPAR是巨噬細胞M2樣表型的主要調節者，PPARγ活化作用使巨噬細胞成為M2樣狀態，具有廣泛的抗炎及組織修復特性，PPARγ活化作用對小膠質細胞有類似作用。由PPAR活化的小膠質細胞可增加對小鼠AD模型的β澱粉樣蛋白斑塊的吞噬攝取並有神經保護作用。考慮到TBI產生大量髓鞘與細胞碎片，PPAR引導的M2樣極化可能利於促進碎片清除。PPAR激動劑在TBI模型中起保護作用，而TBI後給予PPARα受體激動劑非諾貝特可降低創傷後神經炎症反應、氧化應激和腦水腫，改善神經功能。類似的，TBI後使用PPARγ受體激動劑吡格列酮和羅格列酮，可降低創傷後小膠質細胞活化反應並促進抗氧化劑（Mn-SOD）及神經保護分子伴侶（HSP27/70）的表達，減輕神經退變，改善功能。
羅格列酮還引發腦內IL-4的表達，具有依賴IL-4的降低年齡相關的M1樣小膠質活化的作用。所以，TBI模型中PPARγ激動劑的抗炎和神經保護作用可能部分由M2樣小膠質/巨噬細胞極化作用所介導。小膠質細胞代謝型穀氨酸鹽受體5（mGluR5）的選擇性活化可能減弱M1樣小膠質細胞活化及小膠質介導的神經毒性作用。mGluR5的活化在CNS損傷實驗模型中具有強大的神經保護作用,而其激動劑CHPG可減輕TBI後M1樣小膠質細胞的晚期活化，作用通過抑制小膠質細胞NOX2實現。有趣的是，NOX2本身被認為是M1樣和M2樣活化狀態的分子開關，它促進前者而抑制後者。最近發現mGluR5的一個正向別構調節劑VU0360172可使LPS或IFNγ刺激後的小膠質細胞再次向M2表型極化。更多的，除了減輕NOX2在活化小膠質細胞的晚期表達外，VU0360172還可調節TBI後的M1/M2樣平衡，它能減少iNOS（M1樣標誌物）和增加arginase1（M2樣標誌物）的表達，而以M2樣小膠質細胞為主導後可減輕神經退變，改善長期運動功能恢復。
VU0360172還對大鼠實驗性蛛網膜下腔出血有神經保護作用，機制為上調Bcl-2抗凋亡通路。巨噬細胞表型轉換受表觀遺傳機制調節例如，IL-4引起巨噬細胞內組蛋白脫甲基酶Jmjd3上調，改變了染色質修飾而促進M2基因表達並抑制M1基因，Jmjd3通過修飾組蛋白H3K27me3，可加強M2樣小膠質細胞極化反應，抑制帕金森病模型中的Jmjd2可致小膠質細胞過度活化而加重黑質多巴胺能神經元死亡組蛋白去乙醯化酶（histone deocetylase inhibitor，HDAC）使DNA更緊密的包裹於組蛋白周圍，從而阻斷了基因轉錄，對抗促進轉錄的組蛋白乙醯轉移酶活性。許多HDAC抑制劑在TBI後起神經保護作用。Scriptaid是一個Ⅰ/Ⅱ型HDAC的新型抑制劑，即使在TBI後12h應用，仍能發揮其劑量依賴性神經保護功能而改善晚期功能恢復。另外，Scriptaid還通過促使小膠質/巨噬細胞向M2樣表型極化而具有白質保護功能，該功能是通過上調GSK2β實現的，後者通過磷酸化作用使PTEN去活化，啟動PI3K/Akt信號通路。
依賴GSK3β的M2樣表型能發揮抗炎效應，保護少突膠質細胞從而消除白質損傷。所以，抑制小膠質細胞中的HDACs可通過GSK3β/PTEN/Akt改變M1/M2樣平衡，並提供一種促進TBI後組織和功能恢復的新型治療方法。許多其他藥物也用於改變急性CNS損傷後小膠質/巨噬細胞的M1/M2樣極化，包括調節內源性大麻素系統的藥物，CB2反向激動劑，α7菸鹼樣乙醯膽鹼受體激動劑，骨形成蛋白內源性拮抗劑，CCR2拮抗劑等。因此，鑑於M2樣極化的小膠質/巨噬細胞在促進表型相關的CNS損傷修復的地位，改變小膠質細胞和/或巨噬細胞表型和功能的藥物有很大發展前景。
八、改變小膠質/巨噬細胞表型的治療策略的展望
CNS損傷後的廣譜抗炎治療很少成功轉化到臨床應用，部分反映出小膠質細胞M2樣有益作用的不足。似乎有效地組織修復需要M1樣和M2樣功能同時存在，並包括表型間的協同轉化，連續性炎症反應、增殖期和重建期的細微調節。不分時間地將M1向M2表型轉換的方法值得警惕，因為在修復過程早期M1樣反應具有重要地位，在CNS損傷後M1樣小膠質細胞的額外效用還需進一步發現。由於小膠質細胞在雕塑神經環路和突觸重建中具有積極作用，不難理解M1樣小膠質細胞同樣具有在CNS損傷早期將細胞碎片從突觸清除的能力。所以，當尋求調節M1/M2樣表型的治療策略時，為促進有效的組織修復必須特別重視極化狀態轉換的時機，以求將M2樣增強效應精準化，避免長期免疫抑制效應和適應不良的修復過程。已經發現M2樣巨噬細胞驅動的短暫促炎反應後的長程修復過程會導致纖維化和其他異常修復，這是因為arginase活性增高明顯改變了L-精氨酸代謝過程，產生了更多的鳥氨酸和脯氨酸，激發了畸形生長與纖維化的細胞區域。
另外，長期的arginase活性增加導致非耦合的NO產量下降。所以，關鍵在於在正確的時間，由合適的小膠質/巨噬細胞表型驅動內源性修復路徑並避免適應不良。最後，在將嚙齒類M1/M2樣極化狀態轉化到人類時應特別留意，許多常用表型標誌物如arginase1，Ym1（M2樣標誌物），在人類骨髓細胞內不表達.，而其他如CD206、CD163則同樣表達.所以，仔細選擇M2樣極化的標誌物後，在人類CNS損傷後的小膠質細胞和巨噬細胞中的M2樣表型也可以被識別，而具有前景的治療措施則可應用於臨床。
九、總結
根據最近研究，CNS急性創傷後小膠質/巨噬細胞的M1/M2樣極化作用一方面能夠促進神經恢復過程，另一方面阻礙CNS恢復、加重組織損傷，導致晚期神經退變。在CNS重建環境中，M2樣表型可通過影響神經修復的重要過程如神經發生、血管生長、少突膠質細胞生長和髓鞘再生來提高TBI功能恢復。新的以創傷後神經炎症為作用點的治療要避免對小膠質細胞活性的廣泛抑制，而是要改變不同表型之間的平衡關係，這樣才能最大程度促進CNS重建與修復。這一概念被近期的實驗研究所證實。因此，發現小膠質細胞表型轉化的關鍵調節機制，從而最大程度改善CNS創傷後功能恢復是未來研究的方向。
來源：中華神經創傷外科電子雜誌2016年10月第2卷第5期
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