Nat Immunol:一種新型的小膠質細胞研究工具

小膠質細胞和中樞神經系統（CNS）相關的巨噬細胞（CAMs），如血管周圍和腦膜巨噬細胞，幾乎與中樞神經系統的所有疾病相關。然而，由於缺乏合適的工具來區分在個體遺傳學上密切相關的小膠質細胞和CAMs，人們對其細胞類型特異性的特徵知之甚少。

為了建立一種新的小膠質細胞基因靶向模型，作者首先應用大規模平行單細胞分析比較了小膠質細胞和CAM在穩態和疾病過程中的特徵，並發現己糖胺半乳糖苷酶亞基β（Hexb）可作為穩定表達的小膠質細胞核心基因，而其他小膠質細胞核心基因水平在病理過程中則表現出顯著下調。接下來，作者構建了HexbtdTomato小鼠用於監測小膠質細胞在體內的狀態，並證明了Hexb位點可被用於他莫昔芬（Tamoxifen）誘導Cre介導的小膠質細胞基因操作和小膠質細胞的譜系追蹤，且可排除CAMs的影響。

總而言之，這篇文章提供了一種可用於特異性研究中樞神經系統中的小膠質細胞功能的新型工具。

存在於CNS組織中的髓細胞是一類具有異質性的先天免疫細胞，對維持器官內穩態有著重要作用。其中，包括血管周圍巨噬細胞（pvMΦ）和軟腦膜下巨噬細胞（mMΦ）在內的實質性小膠質細胞和CAMs是中樞神經系統的主要器官特異性巨噬細胞，並在穩態和擾亂中起著基礎性的作用。CNS中不同位置的CAMs和小膠質細胞具有不同功能：位於CNS界面的CAMs具有維護邊界完整的作用，位於白質的實質性小膠質細胞對皮質神經元和少突膠質細胞起著支持的作用。

儘管小膠質細胞和CAMs的位置不同，但它們在健康的CNS中具有一些相同的譜系特徵，包括起源、增殖過程以及髓細胞標誌物的表達，如離子鈣接頭分子（Iba）-1， Cx3趨化因子受體1（Cx3cr1）、MER原癌基因酪氨酸蛋白激酶（MerTK）、CD11b和造血標誌物CD45。單細胞轉錄組和蛋白質組分析結合成像技術已經揭示了實質性小膠質細胞和CAMs在穩態和擾亂中具有功能多樣性。在CNS不同的分區中，實質性和非實質性巨噬細胞的定位不同，表明這些髓細胞亞型的功能並不完全相同，但由於缺乏細胞類型特異性的靶向工具，很難明確的界定CNS髓細胞的不同功能。

事實上，先前出現的Cx3cr1Cre和Cx3cr1CrERT2品系以所有CNS巨噬細胞為靶點，未能在基因水平上區分小膠質細胞和CAMs。因此，使用Cx3cr1GFP、Cx3cr1Cre或Cx3cr1CrERT2品系的實驗方法通常將CNS中所有巨噬細胞的混合體作為整體進行評估，而不是只針對小膠質細胞這一類進行研究。此外，現有的轉基因品系如Sall1GFP、Sall1CreERT2、Cx3cr1GFP、Cx3cr1Cre或Cx3cr1CreERT2通常是基於可能導致基因的單倍不足或功能性敲除的敲入策略產生的，因此可能影響小膠質細胞的表型。

因此，迫切需要新的基因工具來對正常生理環境中的實質性小膠質細胞進行研究。單細胞RNA測序（scRNA-seq）和流式細胞術研究表明，小膠質細胞和CAMs具有明顯的核心特徵，包括Tmem119、Siglech、Slc2a5、P2ry12、Fcrls、SalI1、Hexb、Trem2等小膠質細胞表達特徵，而CAMs的表達特徵則是Lyve1、Cd163、Siglec1、Mrc1等基因的高表達。

這篇文章中，作者首先使用大規模平行單細胞測序對不同病理情況下的小膠質細胞關鍵特徵進行全面研究，發現Hexb是一個可以穩定表達的小膠質細胞特徵基因。然後，為觀察及特異性定位小膠質細胞，作者應用CRISPR/Cas9基因編輯技術，構建了兩種新的轉基因小鼠模型，包括在內源性Hexb啟動子的控制下，利用小膠質細胞的自我更新能力，產生tdTomato表達或他莫昔芬（TAM）誘導條件下Cre重組酶表達。這種品系模型可以為深入研究CNS發育、穩態和疾病過程中的小膠質細胞功能提供有價值的資源。

Hexb是穩定表達的小膠質細胞核心基因

對四種不同疾病條件下的小膠質細胞狀態進行的單細胞分析結果顯示，包括Tmem119、P2ry12、Sall1和Cx3cr1在內的大多數典型的小膠質細胞特徵基因在一些神經退行性變和神經炎症狀態均表現出表達水平降低的情況，Hexb在所有疾病模型中均可穩定表達，並且其表達高度局限於小膠質細胞內。

圖1 對脫髓鞘化、髓鞘再生和FNX過程中的單細胞測序分析結果揭示了Hexb是一個穩定表達的小膠質細胞核心基因

圖2 在穩態和自身免疫性神經炎症條件下，Hexb在小膠質細胞中穩定高表達，且在CAMs中不表達

HexbtdT品系小鼠可作為研究小膠質細胞在體活動的工具

作者通過CRISPR/Cas9技術插入T2A-tdTomato基因盒，使得Hexb和tdT的蛋白質表達過程受到內源性HexB基因座的控制，利用免疫螢光染色、免疫螢光成像、流式細胞術、三維重構等技術對8周齡及發育過程中HexbtdT/tdT小鼠腦組織中的tdT+細胞形態、Hexb基因在不同種類細胞中的表達情況等進行觀察並做了定量分析。結果表明，HexbtdT品系模型可作為長時間或在疾病狀態中跟蹤小膠質細胞在體內活動狀態的一種工具。

圖3 HexbtdTomato模型鼠的構建與特徵研究

圖4 對神經退行性變和自身免疫性脫髓鞘過程中HexbtdT小膠質細胞的持續檢測

圖5 HexbtdT小膠質細胞在體動力學研究

構建可用於研究小膠質細胞功能的可誘導的HexbCreERT2系統

為利用Hexb增強子的活性對譜系特徵、基因缺失影響進行研究，作者在Hexb基因座的終止子前插入了T2A-CreERT2基因盒（HexbCreERT2）。在這種情況下，Cre重組酶具有Hexb特異性，且需要雌激素拮抗劑TAM的存在才能激活。通過與Sall1CreERT2、Cx3cr1CreERT2模型對比、組織學檢測等方法驗證了流式細胞術的結果，表明這種TAM誘導的HexbCreERT2系可以在很長一段時間內對小膠質細胞產生高頻、穩定的遺傳修飾，並且對CAMs的影響很小。

圖6 HexbCreERT2小鼠的構建及比較分析

細胞自主性祖細胞在小膠質細胞再增殖中的作用

為探究小膠質細胞與CAMs的再增殖過程是否來源於相同的祖細胞，作者利用BLZ945耗盡成年HexbCreERT2/CreERT2R26yfp/yfp小鼠中所有CSF1R依賴的中樞神經系統巨噬細胞，並對其遺傳譜系進行分析以研究它們的再增殖動力學。研究結果表明，在成年穩定狀態下，中樞神經系統中不同的巨噬細胞（即小膠質細胞和邊緣相關的CAMs），彼此獨立存在，沒有任何細胞水平的交換，在耗竭誘導的情況下，利用特異性的髓細胞介導再增殖。

圖7 對CNS巨噬細胞清除後HexbCreERT2/CreERT2R26yfp/yfp小鼠的遺傳譜系分析

可對成年期的小膠質細胞功能進行研究

為了進一步評估HexbCreERT2系小鼠在研究成年期小膠質細胞功能中的應用，作者通過組織學和流式細胞術分析，分別在TAM注射一周及四周後，對成年HexbCreERT2/CreERT2R26yfp/yfp、HexbCreERT2/CreERT2R26tdT/tdT與Cx3cr1CreERT2/+R26yfp/yfp、Cx3cr1CreERT2/+R26tdT/tdT、Sall1CreERT2/+R26yfp/yfp型小鼠的重組效率和基因重組動力學進行了對比研究，並發現與HexbCreERT2/CreERT2R26tdT/tdT小鼠相比，HexbCreERT2/CreERT2R26yfp/yfp小鼠的小膠質細胞標記水平更高。

HexbCreERT2/CreERT2Csf1rfl/fl小鼠中可產生對於小膠質細胞的選擇性作用

由於CSF1R對所有CNS巨噬細胞的生存有著重要的作用，CSF1R缺失的小鼠中將缺少小膠質細胞和CAMs，作者構建了HexbCreERT2/CreERT2Csf1rfl/fl小鼠以測試HexbCreERT2系的功能，並通過對腦組織進行病理學分析，研究了CSF1R缺失對於小膠質細胞的特異性影響。結果表明，可利用小膠質細胞特異性的CSF1R表達（由HexbCreERT2系統調節），在不影響CNS邊界巨噬細胞數量的情況下分析CNS中實質性巨噬細胞的存活情況。

圖8 Csf1r缺失對CAMs無影響，並對於小膠質細胞有特異性的影響

綜上所述，可誘導的HexbCreERT2系利用了小膠質細胞獨特的性質，包括Hexb的高度限制性表達，及其發育進程特徵，使其區別於遺傳特徵相近的CNS髓細胞和外周血中的髓細胞。本文構建的體系是一個很好的體內模型，可以在特定的時間點對健康和疾病狀態中的小膠質細胞特異性基因進行研究，為探索小膠質細胞開闢了新的途徑。

參考文獻：Masuda, T., Amann, L., Sankowski, R. et al. Novel Hexb-based tools for studying microglia in the CNS. Nat Immunol 21, 802–815 (2020). https://doi.org/10.1038/s41590-020-0707-4

編譯作者：Joanna（brainnews創作團隊）

校審：Simon/Victoria（brainnews編輯部）