如何成為細胞培養大神?

2020-11-23 生物谷


問世間誰人無憂，唯神仙逍遙自在。

作為一名終日泡在實驗室的實驗君，

如何在細胞實驗中無所不能，超脫輪迴

做到一個人人羨慕的細胞大神呢？

且看向這裡，成為細胞大神的六個細節。

 

1. 過濾體系

  自從出現瓶裝培養基之後，培養基過濾的需求就減少了。有些時候，一些特定細胞培養支持物的添加可能會引入一些新的汙染。另外，一般認為，當液體長時間接觸瓶口外的空氣後最好重新過濾；所以一般不建議 管/瓶 對 管/瓶 的傾倒。這時，很多人會選擇Millipore的濾嘴配合針筒進行再過濾。結果發現，完成500 ml培養基過濾後，手疼腰酸！過濾杯的出現完美的解決了這個問題，所以，大體積儘量使用過濾杯吧，可靠且輕鬆，快捷。


默克第二代超濾杯

 

2. 培養基的選擇

關於血清質量，業界流行的澳洲來源 > 北美來源 >南美來源的說法。這一點從價格上也可見一斑。實際情況是優質血清的市場現實是供不應求，所以很多時候大家就將就了之。如果有好的選擇，儘量使用澳洲來源的血清。

對於培養基而言，情況顯然是供大於求的，而且品牌甚多：Sigma，Gibco，Hyclone以及各種國產培養基等，當然一些國外廠商基於競爭及成本的考慮也推出了本土化的培養基。一些人認為培養基能用就行，反正細胞就在那裡長著，也沒出現大規模的傷亡就忽視了培養基的重要性。但是，實驗是對完美的追求，多處將就會導致結果的將就，得不償失！從細胞培養的實際表現（活力，增殖周期，狀態等）看，原裝進口培養基 > 進口分裝培養基 > 大部分國產培養基。所以，別再將就培養基了！

 

如果是因為價格原因而放棄原裝進口培養基，現在好的機會來了。Merck/Sigma推出原裝進口培養基國產價格，覆蓋幾乎全部基礎培養基。

 

 

 

3. 支原體檢測

  支原體汙染和細胞培養機會形影不離，堪稱細胞培養的惡夢。前些年有報導說全球超過60%的實驗室的細胞存在細胞汙染的現象。從早期表現看，支原體汙染會讓你感覺不到，可能僅僅是細胞增速有些減緩；於是還是快樂的做的實驗，結果實驗數據不是很理想。事實是，支原體汙染會影響細胞代謝，改變細胞功能等。

  藥典檢測支原體是培養法，時間以周記，這顯然不符合科研」快」的需求。PCR法應運而生，Sigma的LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit，擴增的是支原體基因組上16S核糖體RNA基因。此區域高度保守，因此可檢測多達19種支原體。但是PCR後的電泳也是一件麻煩的事情，qPCR就是解決方案：LookOut Mycoplasma qPCR Detection Kit。


LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit實際效果

 

4. 胰酶的使用

胰酶適合大部多數細胞的消化：HEK293，CHO，HeLa等，而這類細胞我們往往將他定義為「糙」。當然，細胞本身肯定是不糙的，同樣相當金貴。只不過這些細胞對胰酶的耐受性好，一定濃度下的胰酶對細胞狀態影響不大。

有些細胞就非常金貴了，堪稱「嬌嫩」，比如：幹細胞/">幹細胞等，就不太適合利用胰酶進行消化。另外，如果消化組織進而分離細胞時使用胰酶也是值得小心的。一個好的解決方案是尋找一些溫和的替代品：Accutase、Accumax或EZ-LIFT。這些消化劑劑最大的特點是可替代胰酶，消化後無需用血清失活。尤其是EZ-LiFT™幹細胞/">幹細胞傳代試劑，這是一種無酶、化學成分限定的幹細胞解離試劑，只選擇性傳代未分化的多能幹細胞，避免人工進行群落篩選或細胞刮鏟的步驟，不需要使用ROCK抑制劑即可產生高細胞活性，還可以拯救高度分化的ips細胞培養物。

 

5. 細胞計數

細胞計數是細胞培養的日常。血球計數器、載破片、蓋玻片的組合折磨的每一個技術者的眼睛及耐心。所幸的是，一些公司根據血球計數的原理開發出了自動的計數儀，插入裝有細胞的蓋玻片即可。事實上，基於血球計數原理的另外一個問題是計數的準確性。一般認為CV可能在20%以上，這就非常糟糕了，打算加入10000個細胞，很可能計入了15000個細胞，這是絕對不能接受的。

另外一個計數方法是基於庫爾特原理---類似與流式的方法，將細胞挨個數一遍。看到這個，可能想得是：這麼大的一起，這麼麻煩怎麼做日常計數？Merck的做法是將這個設備小型化了：Sceptor，整體和一把1 ml移液槍類似。15秒內完成細胞技術且CV小於5%。


細胞計數器Sceptor及其數據呈現形式

6. 細胞凍存

細胞傳代過程中涉及細胞凍存。這麼說其實是很有歧義的，嚴格意義上說獲得細胞系完成檢測後第一件事就是大批量凍存細胞，而後開始進行該細胞相關實驗。常規來說，一株細胞的使用周期不宜過長，這樣能排除反覆傳代過程中細胞生物學特性的改變。所以，很多時候他人惠贈的細胞系可能會存在傳代過多的問題，一個好的方案是從ATCC或ECACC（歐洲細胞庫）購買細胞，這些平臺的細胞背景乾淨，傳代次數少。

DMSO是最常用的細胞凍存保護劑，市面上品牌眾多，質量參差不齊。如果使用劣質DMSO凍存細胞，可能從實驗的第一步開始就已經出了細胞品質不好的問題。推薦使用Sigma的DMSO，較多細胞凍存驗證的；或者直接使用其DMSO無血清細胞凍存培養基，確保細胞贏在起跑線。


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